Современные биокатализаторы на основе гексагистидинсодержащей органофосфатгидролазы для химической и биологической защиты

Разработаны биокатализаторы на основе органофосфатгидролазы, модифицированной полигистидиновой последовательностью (His₆-OPH), предназначенные для детоксикации фосфорорганических соединений (ФОС) и разложения N-ацилгомосеринлактонов. Их создание стало возможным благодаря способности фермента His₆-OPH к нековалентному связыванию с различными веществами (полимерами, антиоксидантами, антимикробными средствами и др.). Это же свойство фермента His₆-OPH позволило получить различные стабилизированные нанокомплексы. Показано, что молекулярный докинг разных ФОС и N-ацилгомосеринлактонов может быть проведен с использованием компьютерного моделирования непосредственно к активным центрам димера His₆-OPH, что позволяет теоретически установить новые субстраты для ферментативного гидролиза. Полученные по разработанной технологии биокатализаторы обладают большой стабильностью в различных условиях окружающей среды. Установлено, что полимеры аминокислот (полиглутаминовая и полиаспаргиновая кислоты) являются наиболее эффективными стабилизаторами фермента His₆-OPH, обеспечивающими максимальное сохранение активности фермента. В полученных ферментативных комплексах достигнуто сохранение первоначальных каталитических характеристик фермента до 100%. Фермент His₆-OPH был иммобилизован на полиакриламидном криогеле, модифицированном остатками иминодиуксусной кислотой и заряженном ионами двухвалентных металлов, что позволило получить биокаталитически активные колоночные картриджи для полной деградации различных ФОС в проточных системах. Разработана технология применения иммобилизированного фермента His₆-OPH для разложения ФОС в виде чистых веществ, а также в составе реакционных масс, получаемых после химического разрушения отравляющих веществ. Также иммобилизированную His₆-OPH можно использовать для создания многослойных защитных материалов, эффективно предотвращающих проникновение через них токсичных веществ, таких как VХ, в течение длительного времени. Установлено, что нанобиокатализаторы на основе фермента His₆-OPH обладают антидотными свойствами и способны циркулировать в крови экспериментальных животных по меньшей мере в течение 25 ч. Получены нанокомплексы фермента с соединениями с антиоксидантной активностью, а также с антибиотиками. Наиболее эффективно идет формирование комплекса фермента His₆-OPH с антибиотиками, содержащими ß-лактамное кольцо. Взаимодействие различных химических веществ с His₆-OPH может быть компьютерно смоделировано таким образом, чтобы выявить новые возможные каталитически активные комбинации для фермента. Это позволяет предварительно прогнозировать возможность и эффективность использования ферментных биокатализаторов как антидотов или дегазирующих средств в отношении различных ФОС.

1. A recombinant plasmid рTES-His-OPH and a producer of oligohistidine-containing organophosphorus hydrolase // Patent RU № 2255975, 2005.

2. A method of enzymatic hydrolysis of chemical warfare agents // Patent RU № 2296164, 2007.

3. A method of biodegradation of organophosphorus compounds in the reaction mass obtained after chemical destruction of R-VX // Patent RU №2408724, 2011.

4. A biocatalyst based on immobilized bacterial cells for decomposition of methylphosphonic acid // Patent RU №2360967, 2009.

5. A method of producing a biocatalyst and a biocatalyst for detoxification of organophosphorus compounds in the flow-trough systems // Patent RU № 2315103, 2008.

6. A method of enzymatic hydrolysis of organophosphorus compounds in soil // Patent RU № 2451077, 2012.

7. A method of producing a biocatalyst and a biocatalyst for hydrolysis of organophosphorus compounds // Patent RU № 2261911, 2005.

8. A filtering sorbing self-degassing material for personal protective equipment against exposure to organophosphorus compounds // Patent RU № 2330717, 2008.

9. A nanoscale enzyme biocatalyst for detoxification of organophosphorus compounds in vivo // Patent RU № 2525658, 2014.

10. An enzyme biocatalyst for neutralization of organophosphorus compounds in vivo // Patent RU № 2575627, 2016.

11. A cryoformed enzyme biocatalyst for hydrolysis of organophosphorus compounds // Patent RU № 2615176, 2017.

12. Lyagin I.V., Efremenko E.N. Biomolecular engineering of biocatalysts hydrolyzing neurotoxic organophosphates // Biochimie. 2018. V. 144, P. 115–121.

13. Efremenko E.N., Lyagin I.V., Klyachko N.L. et al. A simple and highly effective catalytic nanozyme scavenger for organophosphorus neurotoxins // J. Control. Release. 2017. V. 247. P.175-181.

14. Maslova O., Aslanli A., Stepanov N. et al. Catalytic characteristics of new antibacterials based on hexahistidine-containing organophosphorus hydrolase // Catalysts. 2017. V. 7. № 9. P. 271.

15. An enzyme biocatalyst with antioxidant activity for detoxification of organophosphorus compounds // Patent RU № 2648169, 2018.

16. Efremenko E.N., Lyagin I.V., Cuong L.H.et al. Antioxidants as stabilizers for His 6-OPH: is this an unusual or regular role for them with enzymes? // J. Biochem. 2017. V. 162. № 5. P. 327–334.

17. Maslova O.V., Senko O.V., Stepanov N.A., et al. His6- OPH and its stabilized forms combating quorum sensing molecules of gram-negative bacteria in combination with antibiotics // JJNPP. 2017. V. 12. № 3. P. e63649.

18. Maslova O.V., Aslanli A.G., Senko O.V. et al. The possibilities of reducing the minimal inhibitory concentration of puromycin and ceftiofur with their combination with His 6-OPH-based biologics // Moscow University Chemistry Bulletin. 2018. V. 73. P. 298–302.

19. Aslanli A., Lyagin I., Efremenko E. Novel approach to Quorum Quenching: rational design of antibacterials in combination with hexahistidine-tagged organophosphorus hydrolase // Biol. Chem. 2018. V. 399. № 8. P. 869–879.

20. Sirotkina M., Efremenko E.N. Rhodococcus lactonase with organophosphate hydrolase (OPH) activity and His6-tagged OPH with lactonase activity: evolutionary proximity of the enzymes and new possibilities in their application // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2014. V. 98. P. 2647–2656.

21. Lyagin I.V., Andrianova M.S., Efremenko E.N. Extensive hydrolysis of phosphonates as unexpected behaviour of the known His 6-organophosphorus hydrolase // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016. V. 100. № 13. P. 5829–5838.

22. Lyagin I., Efremenko E. Theoretical evaluation of suspected enzymatic hydrolysis of Novichok agents // Catal. Commun. 2019. V. 120. P. 91–94.