ПЦР-амплифицированный иммуноанализ (иммуно-ПЦР): принцип метода, варианты исполнения, возможности и перспективы использования для выявления патогенных биологических агентов

«Золотым стандартом» выявления биологических патогенов на сегодняшний день являются иммуноферментный анализ и полимеразная цепная реакция. Объединить оба метода в единую платформу, сохранить их преимущества, добиться высокой чувствительности анализа позволяет метод амплифицированного иммуноанализа – иммуно-ПЦР. Цель работы – рассмотреть возможности и перспективы использования ПЦР-амплифицированного иммуноанализа для выявления патогенных биологических агентов. Иммуно-ПЦР позволяет обнаруживать различные антигенные детерминанты ненуклеиновой природы в ПЦР за счет амплификации ДНК-метки, конъюгированной со специфическим антителом. Регистрация результата при этом также возможна в режиме реального времени по аналогии с тест-системами «real time» ПЦР. Основными методическими вопросами в технологии иммуно-ПЦР являются: выбор носителя комплексов биомолекул, выбор метода конъюгации антител детекции и репортерной нуклеиновой кислоты, оптимизация способов амплификации сигнальной ДНК и учета результатов, разработка способов снижения фоновых показателей. Мы считаем целесообразным проведение научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ по разработке и созданию диагностических наборов реагентов на основе иммуно-ПЦР. Применительно к задаче обнаружения малых и следовых количеств антигенов патогенных биологических агентов, наиболее вероятной диагностической «нишей» метода иммуно-ПЦР будет выявление токсинов микробного и немикробного происхождения, минимальная клинически значимая доза для которых меньше чувствительности соответствующих иммунохимических тест-систем. С учетом перспектив развития метода, в будущем возможна разработка таких тест-систем для выявления аналитов-гаптенов, например некоторых токсикантов небиологического происхождения.

1. Кишкун А.А. Клиническая лабораторная диагностика: учебное пособие. 2-е изд., перераб. и доп. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2019. 832 с.

2. Рязанцев Д.Ю., Воронина Д.В., Завриев С.К. Иммуно-ПЦР: Достижения и перспективы // Успехи биологической химии. 2016. Т. 56. С. 377–410.

3. Chang L., Li J., Wang L. Immuno-PCR: An ultrasensitive immunoassay for biomolecular detection // Anal. Chim. Acta. 2016. V. 910. P. 12–24. https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.12.039

4. Sano T., Smith C.L., Cantor Ch.R. Immuno-PCR: very sensitive antigen detection by means of specific antibody-DNA conjugates // Science. 1992. V. 258. P. 120–122. https://doi.org/10.1126/science.1439758

5. Deng M., Long L., Xiao X. et al. ImmunoPCR for one step detection of H5N1 avian influenza virus and Newcastle disease virus using magnetic gold particles as carriers // Vet. Immunol. Immunopathol. 2011. V. 141. № 3–4. P. 183–189. https://doi.org/10.1016/j.vetimm.2011.02.018.

6. Кульбачинский А.В. Методы отбора аптамеров к белковым мишеням // Успехи биологической химии. 2006. Т. 46. С. 193–224.

7. Morin I., Askin S.P., Schaeffer P.M. IgG-detection devices for the Tus-Ter-lock immuno-PCR diagnostic platform // Analyst. 2011. V. 136. № 22. P. 4815–4821. https://doi.org/10.1039/c1an15731k

8. Johnston E.B., Kamath S.D., Lopata A.L. et al. Tus-Ter-lock immuno-PCR assays for the sensitive detection of tropomyosin-specic IgE antibodies // Bioanalysis. 2014. V. 6. № 4. P. 465–476. https://doi.org/10.4155/bio.13.315

9. Zhou H., Fisher R.J., Papas T.S. Universal immuno-PCR for ultra-sensitive target protein detection // Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 6038–6039. https://doi.org/10.1093/nar/21.25.6038

10. Neylon C., Kralicek A.V., Hill T. M., Dixon N.E. Replication termination in Escherichia coli: structure and antihelicase activity of the Tus-Ter complex // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2005. V. 69. № 3. P. 501–526. https://doi.org/10.1128/MMBR.69.3.501-526.2005

11. Gottlieb P.A., Wu S., Zhang X. et al. Equilibrium, kinetic, and footprinting studies of the Tus-Ter proteinDNA interaction // J. Biol Chem. 1992. V. 267. № 11. P. 7434–7443. https://doi.org/10.3390/molecules24081572

12. Лахин А.В., Тарантул В.З., Генинг Л.В. Аптамеры: проблемы, пути их решения и перспективы // Acta Naturae. 2013. T. 5. № 4. C. 28–39

13. Sullivan R., Adams M.C., Naik R.R., Milam V.T. Analyzing secondary structure patterns in DNA aptamers identified via CompELS // Molecules. 2019. V. 24. № 8. P. 1572. https://doi.org/10.3390/molecules24081572

14. Чумаков А.М., Юхина Е.С., Фролова Е.И. и др. Расширение возможностей применения ДНК-аптамеров путем их функционализации / // Биоорганическая химия. 2016. T. 42. № 1. С. 3–17.

15. Anzai H., Terai T., Jayathilake C. et al. A novel immuno-PCR method using cDNA display // Anal. Biochem. 2019. V. 578. P. 1–6. https://doi.org/10.1016/j.ab.2019.04.017

16. Graner M., Pointon T., Manton S. et al. Oligoclonal IgG antibodies in multiple sclerosis target patient-specific peptides // PLoS One. 2020. V. 15. № 2. e0228883. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0228883

17. Rezaei Z.S., Shahangian S.S., Hasannia S., Sajedi R.H. Development of a phage display-mediated immunoassay for the detection of vascular endothelial growth factor // Anal. Bioanal. Chem. 2020. V. 412. № 27. P. 7639–7648. https://doi.org/10.1007/s00216-020-02901-4

18. Zhao L., Zhou H., Sun T. et al. Complete antigen-bridged DNA strand displacement amplification immuno-PCR assay for ultrasensitive detection of salbutamol // Sci. Total Environ. 2020. V. 748. P. 142330. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2020.142330

19. Mehta P.K., Dahiya B., Sharma S. et al. Immuno-PCR, a new technique for the serodiagnosis of tuberculosis // J. Microbiol. Methods. 2017. V. 139. P. 218–229. https://doi.org/10.1016/j.mimet.2017.05.009

20. Sharma S., Sheoran A., Gupta K.B. et al. Quantitative detection of a cocktail of mycobacterial MPT64 and PstS1 in tuberculosis patients by real-time immuno-PCR // Future Microbiol. 2019. V. 14. P. 223– 233. https://doi.org/10.2217/fmb-2018-0284

21. Маерле А.В., Рязанцев Д.Ю., Дмитренко О.А. и др. Определение токсинов Staphylococcus aureus методом иммуно-ПЦР // Биоорганическая химия. 2014. Т. 40. № 5. С. 571.

22. Kirchner M., Sayers E., Cawthraw S. et al. A sensitive method for the recovery of Escherichia coli serogroup O55 including Shiga toxin-producing variants for potential use in outbreaks // J. Appl. Microbiol. 2019. V. 127. № 3. P. 889–896. https://doi.org/10.1111/jam.14345

23. Kolesnikov A.V., Kozyr A.V., Ryabko A.K., Shemyakin I.G. Ultrasensitive detection of protease activity of anthrax and botulinum toxins by a new PCRbased assay // Pathog. Dis. 2016. V. 74. № 1. P.112. https://doi.org/10.1093/femspd/ftv112

24. Das S., Majumder S., Nag M., Kingston J.J. A sandwich duplex immuno PCR for rapid and sensitive identification of Clostridium perfringens alpha and enterotoxin // Anaerobe. 2019. V. 57. P. 63–74. https://doi.org/10.1016/j.anaerobe.2019.03.015

25. Ren X., Zhang Q., Wu W. et al. Anti-idiotypic nanobody-phage display-mediated real-time immunoPCR for sensitive, simultaneous and quantitative detection of total aflatoxins and zearalenone in grains // Food Chem. 2019. V. 297. P. 124912. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2019.05.186

26. Huang W., Tu Z., Ning Z. et al. Development of real-time immuno-PCR based on phage displayed an anti-idiotypic nanobody for quantitative determination of citrinin in monascus // Toxins (Basel). 2019. V. 11. № 10. P. 572. https://doi.org/10.3390/toxins11100572

27. Guan N., Li Y., Yang H., Hu P. et al. Dualfunctionalized gold nanoparticles probe based biobarcode immuno-PCR for the detection of glyphosate // Food Chem. 2021. V. 338. P. 128133. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2020.128133

28. He X., McMahon S., McKeon T.A., Brandon D.L. Development of a novel immuno-PCR assay for detection of ricin in ground beef, liquid chicken egg, and milk // J. Food Prot. 2010. V. 73. № 4. P. 695–700. https://doi.org/10.4315/0362-028x-73.4.695

29. Баркова И.А, Барков А.М., Викторов Д.Н. Метод иммуно-ПЦР в диагностике бактериальных и вирусных инфекций // Журн. микробиол. 2019. № 3. С. 110–117.