Современные подходы к решению задач по подготовке проб к анализу методом полимеразной цепной реакции

Чувствительность, специфичность и воспроизводимость молекулярно-генетических методов анализа во многом зависит от качества предварительной подготовки анализируемых образцов. В ходе пробоподготовки решаются задачи обеззараживания патогенного материала, лизирования клеточных мембран, удаления соединений, и примесей ингибирующих полимеразную цепную реакцию (ПЦР), а также концентрирования нуклеиновых кислот. Цель работы – выбор современных подходов к подготовке проб к анализу методом ПЦР. Среди многообразия различных способов подготовки проб наибольшее распространение получили методы, основанные на химическом лизисе клеточных мембран с применением хаотропных соединений, с последующей очисткой нуклеиновых кислот твердофазной экстракцией с применением магнитных частиц. Этот подход реализован как в коммерческих наборах реагентов для ручной пробоподготовки, так и в различных автоматизированных системах для выделения нуклеиновых кислот. Анализ серийно выпускаемых станций для выделения нуклеиновых кислот, показал, что их технические характеристики схожи: продолжительность одного цикла выделения 40–90 мин; Объем анализируемых проб – от 0,1 до 2,0 мл; количество одновременно обрабатываемых проб max – 96, min – 8. Метод выделения нуклеиновой кислоты – магнитные частицы. Основные различия заключаются по виду анализируемых образцов, и технологий лизиса исследуемого материала и экстракции ДНК. Наш опыт применения содержащих магнитные частицы наборов для выделения нуклеиновых кислот, как в стационарных лабораториях, так и в полевых условиях, в частности, при эксплуатации многофункционального мобильного модульного комплекса «Сыч», подтверждает эффективность и надежность этой технологии. Дальнейшее развитие и совершенствование аппаратурного обеспечения таких работ будет, очевидно, направлено на миниатюризацию оборудования, разработку полевых портативных автоматических станций выделения нуклеиновых кислот, а также интеграцию процесса подготовки проб и их анализа методом ПЦР в одном устройстве.

1. Bloomfield M., Balm M., Blackmore T. Molecular testing for viral and bacterial enteric pathogens: gold standard for viruses, but don’t let culture go just yet? // Pathology. 2015. V. 47. P. 227-233. https://doi.org/10.1097/PAT.0000000000000233

2. Abayasekara L., Perera J., Chandrasekharan V. et al. Detection of bacterial pathogens from clinical specimens using conventional microbial culture and 16S metagenomics: a comparative study // BMC Infect. Dis. 2017. V. 17. Р. 631. https://doi.org/10.1186/s12879-017-2727-8

3. Murphy J., Bustin S. Reliability of real-time reverse-transcription PCR in clinical diagnostics: gold standard or substandard? // Expert Rev. Mol. Diagn. 2009. V. 9. P. 187–197. https://doi.org/10.1586/14737159.9.2.187

4. Кибирев Я.А., Бурлачук С.Е., Грудцына А.С. и др. Методы идентификации возбудителей опасных и особо опасных инфекционных заболеваний, основанные на анализе нуклеиновых кислот // Вестник войск РХБ защиты. 2018. Т. 2. № 4. С. 22–35.

5. Demeke T., Jenkins R. Influence of DNA extraction methods, PCR inhibitors and quantification methods on real-time PCR assay of biotechnologyderived traits // Anal. Bioanal. Chem. 2010. V. 396. P. 1977-1990. https://doi.org/10.1007/s00216-009-3150-9

6. Maja Sidstedt M.,Rådström P., Hedman J. PCR inhibition in qPCR, dPCR and MPS—mechanisms and solutions // Anal. Bioanal. Chem. 2020. V. 412. P. 2009– 2023. https://doi.org/10.1007/s00216-020-02490-2

7. Шапхаев Э.Г., Цыренов В.Ж., Чебунина Е.И. Основы биотехнологии. Издательство ВСГТУ. 2005. 94 с.

8. Wink M. An introduction to molecular biotechnology: molecular fundamentals, methods and application in modern biotechnology. Wiley-VCH. Weinheim. Germany. 2006.

9. Ali N., de Rampazzo R., Costa A. et al. Current nucleic acid extraction methods and their implications to point-of-care diagnostics // BioMed Res. Int. 2017. V. 2017. 9306564. https://doi.org/10.1155/2017/9306564

10. Hedman J., Rådström P. Overcoming inhibition in realtime diagnostic PCR // Meth. Mol. Biol. 2013. V. 943. P. 17–48. https://doi.org/10.1007/978-1-60327-353-4_2

11. Sidstedt M., Hedman J., Romsos E.L. et al. Inhibition mechanisms of hemoglobin, immunoglobulin G, and whole blood in digital and real-time PCR // Anal. Bioanal. Chem. 2018. V. 410. P. 2569–2583. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0931-z

12. Wilson I. Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification // Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63. P. 3741–3751.

13. Rådström P., Knutsson R., Wolffs P., et al. PrePCR processing: Strategies to generate PCR-compatible samples // Mol. Biotechnol. 2004. V. 26. P. 133–146. https://doi.org/10.1385/MB:26:2:13

14. Антонова О.С., Корнева Н.А., Белов Ю.В. и др. Эффективные методы выделения нуклеиновых кислот для проведения анализов в молекулярной биологии (Обзор) // Научное Приборостроение. 2010. Т. 20. № 1. С. 3–9.

15. Eslami G., Khalatbari-Limaki S., Ehrampoush M.H. et al. Comparison of three different DNA extraction methods for Linguatula serrata as a food born pathogen // Iranian J. Parasitol. 2017. V. 12. P. 236-242.

16. Tan S.C., Yiap B.C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present // J. Biomed. Biotechnol. 2009. V. 2009. 574398. https://doi.org/10.1155/2009/574398.

17. Oskam C.L., Haile J., McLay E. et al. Fossil avian eggshell preserves ancient DNA // Proc. R. Soc. B. 2010. V. 277. P. 1991–2000. http://doi.org/10.1098/rspb.2009.2019

18. Грачев М.А., Кузнецова С.Ю., Щербакова Т.А. Метод выделения высокоочищенной ДНК для использования в полимеразной цепной реакции // Молекулярная биология. 2006. Т. 40. № 1. С. 180-183.

19. Zähringer H. Don’t lose the thread. Product survey: Manual DNA extraction kits // Lab Times. 2012. V. 6, P. 52–56. URL: https://docplayer.net/53735876-Pure-dnadevoid-of-impurities-from.htm.

20. Doebler R.W., Erwin B., Hickerson A. et al. Continuous-flow, rapid lysis devices for biodefense nucleic acid diagnostic systems // JALA. 2009. V. 14. P. 119-125. https://doi.org/10.1016/j.jala.2009.02.010

21. Chacon-Cortes D., Griffiths L. Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples: current perspectives // J. Biorepository Science for Applied Medicine, 2014. V. 2. P. 1–9. https://doi.org/10.2147/BSAM.S46573

22. Archer M. J., Lin B., Wang Z. et al. Magnetic bead-based solid phase for selective extraction of genomic DNA // Anal. Biochem. 2006. V. 355. P. 285-297. https://doi.org/10.1016/j.ab.2006.05.005

23. Thatcher S.A. DNA/RNA preparation for molecular detection // Clin. Chem. 2015. V. 61. P. 89–99. https://doi.org/10.1373/clinchem.2014.221374

24. Berensmeier S. Magnetic particles for the separation and purification of nucleic acids // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. V. 73. P. 495–504. https://doi.org/10.1007/s00253-006-0675-0

25. Phillips K., McCallum N., Welch L. A comparison of methods for forensic DNA extraction: Chelex-100® and the QIAGEN DNA Investigator Kit // Forensic Sci. Int. Genet. 2012. V. 6. P. 282–285. https://doi.org/10.1016/j.fsigen.2011.04.018

26. Schrader C., Schielke A., Ellerbroek L. et al. PCR inhibitors—occurrence, properties and removal // J. App. Microb. 2012. V. 113. P. 1014–1026. https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2012.05384.x

27. de Boer R, Peters R, Gierveld S. et al. Improved detection of microbial DNA after bead-beating before DNA isolation // J. Microbiol. Methods. 2010. V. 80. P. 209–211. https://doi.org/10.1016/j.mimet.2009.11.009

28. Verheyen J., Kaiser R., Bozic M. et al. Extraction of viral nucleic acids: comparison of 5 automated nucleic acid extraction platforms // J. Clin. Virol. 2012. V. 54. P. 255–259. https://doi.org/0.1016/j.jcv.2012.03.008

29. Shipley M., Koehler J., Kulesh D. et al. Comparison of nucleic acid extraction platforms for detection of select biothreat agents for use in clinical resource limited settings // J. Microbiol. Methods. 2012. V. 91. P. 179–183. https://doi.org/10.1016/j.mimet.2012.06.008

30. Mauk M., Liu C., Sadik M. et al. Microfluidic devices for nucleic acid (NA) isolation, isothermal NA amplification, and real-time detection // Methods Mol. Biol. 2015. V. 1256. P. 15–40. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-2172-0_2

31. Saeed M., Ahmad M., Iram S. et al. GeneXpert technology. A breakthrough for the diagnosis of tuberculous pericarditis and pleuritis in less than 2 hours // Saudi Med. J. 2017. V. 38. No. 7. P. 699–705. https://doi.org/10.15537/smj.2017.7.17694

32. Poritz M., Blaschke A., Byington C. et al. FilmArray, an automated nested multiplex PCR system for multi-pathogen detection: development and application to respiratory tract infection // PLoS One. 2011. V. 6. e26047. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0026047