Современные подходы в области молекулярной генетики вирусов при изучении представителей семейства Coronaviridae

Существующие подозрения об искусственном происхождении пандемии COVID-19 и об использовании технологии обратной генетики для создания вируса SARS-CoV-2 требуют понимания ее возможностей в конструировании новых вирусов. Цель работы – показать, каким образом применение обратной генетики позволяет конструировать ранее не существовавшие коронавирусы, технологии и основные достижения в их создании. Для подготовки данной статьи использовалась информация, находящаяся в открытом доступе и легко проверяемая по приведенным источникам. Название технологии – «обратная генетика» – произошло из-за того, что при получении способных к размножению РНК-вирусов идут не от ДНК к РНК, как это обычно делается в клетке при синтезе белка, а наоборот, от РНК вируса к комплементарной ей ДНК (кДНК), а с нее с помощью РНК-полимеразы фага Т7 – «обратно» к инфекционной РНК. Так как полученная плюс-РНК генома коронавируса имитирует клеточную матричную РНК (мРНК), она немедленно распознается машиной трансляции клетки и запускает формирование собственных инфекционных вирусных частиц. Разработано две системы обратной генетики, предполагающие получение инфекционной плюс-РНК – в условиях in vitro и in vivo. Проблема получения полноразмерной кДНК гигантского генома коронавирусов решается путем его фрагментации и последующей сшивки фрагментов с использованием стандартных подходов молекулярной биологии. В статье приведены примеры, каким образом данная технология позволяет получать синтетические коронавирусы, по свойствам неотличимые от выделенных из природы, менять круг их хозяев, усиливать вирулентность и устойчивость к специфическим антителам, влиять на патогенез болезни. Также показаны перспективы использования рекомбинантных вирусов в клеточных скрининговых анализах и моделях инфекции in vivo для идентификации профилактических и терапевтических подходов к лечению вирусных инфекций.

1. Yount B., Curtis K., Baric R. Strategy for systematic assembly of large RNA and DNA genomes: transmissible gastroenteritis virus model // J. Virol. 2000. V. 74(22). P. 10600–10611. https://doi.org/10.1128/JVI.74.22.10600-10611.2000

2. Yount B., Denison M. Weiss S., Baric R. Systematic assembly of a full-length infectious cDNA of mouse hepatitis virus strain A59 // J. Virol. 2002. V. 76(21). P. 11065–11078. https://doi.org/10.1128/JVI.76.21.11065-11078.2002

3. Ren W., QuX., Li W., Shi1 Z. et al. Difference in receptor usage between Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS) coronavirus and SARS-Like coronavirus of bat origin // J. Virol. 2008. V. 82(4). P. 1899–1907. https://doi.org/10.1128/JVI.01085-07

4. Thao T.T.N., Labroussaa F., Thiel V. Rapid reconstruction of SARS-CoV-2 using a synthetic genomics platform // Nature. 2020. V. 582. P. 561–565. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2294-9

5. Xie X., Muruato A., Lokugamage K.G. et al. An infectious cDNA clone of SARS-CoV-2 // Cell Host Microbe. 2020 May 13. V. 27(5). P. 841–848.e3. https://doi.org/10.1016/j.chom.2020.04.004

6. Xie X., Lokugamage K.G., Zhang X. et al. Engineering SARS-CoV-2 using a reverse genetic system // Nat. Protoc. 2021. V. 16(3). P. 1761–1784. https://doi.org/10.1038/s41596-021-00491-8

7. Ye Ch., Chiem K., Park J-G et al. Rescue of SARSCoV-2 from a single bacterial artificial chromosome // mBio. 2020. 11(5): e02168-20. https://doi.org/10.1128/mBio.02168-20

8. Rihn S., Merits A., Bakshi S. et al. A plasmid DNA-launched SARS-CoV-2 reverse genetics system and coronavirus toolkit for COVID-19 research // PLoS Biol. 2021. V. 19(2). e3001091. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001091

9. Menachery V.D., Yount B.L., Debbink K. et al. SARS-like cluster of circulating bat coronavirus pose threat for human emergence // Nat. Med. 2015. V. 21, № 12. P. 1508–1513. https://doi.org/10.1038/nm.3985/(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4797993/)

10. Lakota J. Today`s Biothreats – Where the Past Predictions Meet the Future // Journal of NBC Protection Corps. 2020. V. 4. No 4. P. 421–440. https://doi.org/10.35825/2587-5728-2020-4-4-421-430

11. Lakota J. Synthetic Biology – Friend or Foe? What Kind of Threats Should We Expect? // Journal of NBC Protection Corps. 2021. V. 5. № 2. P. 103–122. https://doi.org/10.35825/2587-5728-2021-5-2-103-122

12. Godeke G-J., de Haan C.A.M., Rossen J.W.A. et al. Assembly of spikes into coronavirus particles is mediated by the carboxy-terminal domain of the spike protein // J. Virol. 1999. V. 74. P. 1566–1571. https://doi.org/10.1128/jvi.74.3.1566-1571.2000

13. Opstelten D-J.E., Raamsman M.J.B, Wolfs K. et al. Envelope glycoprotein interactions in coronavirus assembly // J. Cell Biol. 1995. V. 131. P. 339–349. https://doi.org/10.1083/jcb.131.2.339

14. Kuo L., Godeke G-J., Raamsman M.J. et al. Retargeting of coronavirus by substitution of the spike glycoprotein ectodomain: crossing the host cell species barrier // J. Virol. 2000. V. 74(3). P. 1393–1406. https://doi.org/10.1128/jvi.74.3.1393-1406.2000

15. Perez D.R., Cockrell A.S., Beall A. et al. Efficient reverse genetic systems for rapid genetic manipulation of emergent and preemergent infectious coronaviruses // Reverse Genetics of RNA Viruses. 2017. V. 1602. P. 59– 81. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-6964-7_5

16. Yount B., Curtis K.M., Fritz E.A. et al. Reverse genetics with a full-length infectious cDNA of severe acute respiratory syndrome coronavirus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100(22). P. 12995–13000. https://doi.org/10.1073/pnas.1735582100

17. Kouprina N., Larionov V. Selective isolation of genomic loci from complex genomes by transformationassociated recombination cloning in the yeast Saccharomyces cerevisiae // Nat. Protoc. 2008. V. 3(3). P. 371–377. https://doi.org/10.1038/nprot.2008.5

18. de Haan С., Li Z., Lintelo E. et al. Murine coronavirus with an extended host range uses heparan sulfate as an entry receptor // J. Virol. 2005. V. 79(22). P. 14451–14456. https://doi.org/10.1128/JVI.79.22.14451-14456.2005

19. Follis K.E., York J., Nunberg J.H. Furin cleavage of the SARS coronavirus spike glycoprotein enhances cell–cell fusion but does not affect virion entry // Virology. 2006. V. 350(2). P. 358–369. https://doi.org/10.1016/j.virol.2006.02.003

20. Eckert D.M., Kim P.S. Mechanisms of viral membrane fusion and its inhibition // Ann.l Rev. Biochem. 2001. V. 70. P. 777–810. https://doi.org/10.1146/annurev.biochem.70.1.777

21. Watanabe R., Matsuyama S., Shirato K. et al. Entry from the cell surface of severe acute respiratory syndrome coronavirus with cleaved S protein as revealed by pseudotype virus bearing cleaved S protein // J. Virol. 2008. V. 82(23). P. 11985–11991. https://doi.org/10.1128/JVI.01412-08

22. Rockx B., Sheahan T., Donaldson E. et al. Synthetic reconstruction of zoonotic and early human severe acute respiratory syndrome coronavirus isolates that produce fatal disease in aged mice // J. Virol. 2007. V. 81. P. 7410–7423. https://doi.org/10.1128/JVI.00505-07

23. Becker M.M., Graham R.L., Donaldson F. et al. Synthetic recombinant bat SARS-like coronavirus is infectious in cultured cells and in mice // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. V. 105(50). P. 19944–19949. https://doi.org/10.1073/pnas.0808116105

24. Sheahan T. Rockx B., Donaldson E. et al. Mechanisms of zoonotic severe acute respiratory syndrome coronavirus host range expansion in human airway epithelium // J. Virol. 2008. V. 82. P. 2274–2285. https://doi.org/10.1128/JVI.02041-07

25. Bolles M., Deming D., Long K. et al. A double-inactivated severe acute respiratory syndrome coronavirus vaccine provides incomplete protection in mice and induces increased eosinophilic proinflammatory pulmonary response upon challenge // J. Virol. 2011. V. 85. P. 12201–12215. https://doi.org/10.1128/JVI.06048-11

26. Li F. Structure, function, and evolution of coronavirus spike proteins // Ann. Rev. Virol. 2016. V. 29. P. 237–261. https://doi.org/10.1146/annurevvirology-110615-042301

27. Menachery V., Yount B., Sims A. et al. SARSlike WIV1-CoV poised for human emergence // PNAS. 2016. V. 113 (11). P. 3048–3053. https://doi.org/10.1073/pnas.1517719113

28. Sia S.F., Yan L-M., Chin A.W.H. et al. Pathogenesis and transmission of SARS-CoV-2 in golden hamsters // Nature. 2020. V. 583. P. 834–838. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2342-5.

29. Pickard A., Calverley B., Chang J. et al. Discovery of re-purposed drugs that slow SARS-CoV-2 replication in human cells // PLoS Pathog. 2021. V. 17(9). e1009840. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009840

30. Medical aspects of chemical and biological warfare / Ed. Sidell F.R., Tafuqi E.T., Franz D.R. Washington. 1997.

31. Jackson P.J., Ramsay A.J., Christensen C.D. et al. Expression of mouse interleukin-4 by a recombinant ectromelia virus suppresses cytolytic lymphocyte responses and overcomes genetic resistаnce to mousepox // J. Virol. 2001. V. 75(3). P. 1205–1210. https://doi.org/10.1128/JVI.75.3.1205-1210.2001

32. Cheng J., Zhao Y., Xu G. et al. The S2 subunit of QX-type infectious bronchitis coronavirus spike protein is an essential determinant of neurotropism // Viruses. 2019. V. 11(10). 972. https://doi.org/10.3390/v11100972

33. Nagy A., Pongor S., Gyorffy B. Different mutations in SARS-CoV-2 associate with severe and mild outcome // Int. J. Antimicrob. Agents. 2021. V. 57. P. 106272. https://doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2020.106272

34. Segreto R., Deigin Y., McCairn K., Sousa A. et al. Should we discount the laboratory origin of COVID-19? // Environ. Chem. Lett. 2021. Mar 25. P. 1–15. https://doi.org/10.1007/s10311-021-01211-0

35. Markson S. What really happened in Wuhan. Harper Collins Publishers Australia Pty Limited. ISBN 978 1 4607 6092 5. 2021.