Разработка способа обнаружения и идентификации ДНК токсигенных штаммов Clostridium botulinum типов А, В, Е методом ПЦР в реальном времени

Бактерия Clostridium botulinum вызывает у человека опасную токсикоинфекцию – ботулизм. Летальность при ботулизме в случаях несвоевременного обращения за медицинской помощью достигает 70% от количества заболевших. В основе патогенеза ботулизма лежит поражение центральной нервной системы токсином, продуцируемым C. botulinum. В настоящее время известно 7 антигенных типов такого токсина. Ботулотоксин входит в группу биологических агентов, наиболее вероятных в качестве средств биотерроризма. Так как ботулинический нейротоксин представляет собой сложный нуклеопротеиновый комплекс и следы ДНК могут быть обнаружены даже в очищенных препаратах токсина, мы разработали способ обнаружения и идентификации токсигенных штаммов Clostridium botulinum типов А, В, Е, наиболее часто вызывающих ботулизм у человека, основанный на выявлении остаточных количеств этой ДНК в ботулиническом токсине с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени. Основным препятствием для разработки способа обнаружения и идентификации ДНК токсигенных штаммов стала высокая вариабельность генов, ответственных за синтез ботулотоксина. Нами установлен участок гена, обладающий наименьшей гомологией у всех штаммов. Этому требованию отвечал фрагмент гена bont, кодирующий легкую цепь нейротоксина и обладающий высокой консервативностью в пределах штаммов C. botulinum, продуцирующих один тип токсина. Представлены результаты по определению аналитической чувствительности и специфической активности разработанного способа. Специфичность определения составила 100%, аналитическая чувствительность метода – 1×10² м.к./мл. Способ может быть использован для анализа продуктов питания, образцов клинических материалов и проб из окружающей среды, подозрительных на контаминацию токсигенными штаммами C. botulinum.

1. Инфекционные болезни: национальное руководство / Под ред. Ющука Н.Д., Венгерова Ю.Я. М.: 2009.

2. Супотницкий М.В. Биологическая война. Введение в эпидемиологию искусственных эпидемических процессов и биологических поражений: монография. М.: 2013.

3. Взаимодействие органов управления, учреждений и специализированных формирований при ликвидации последствий террористических актов с применением патогенных биологических агентов и опасных химических веществ МР 0100/3556-04-34 М., 2004. 42 с.

4. Campbell K.D., Collins M.D., East A.K. Gene probes for identification of the botulinum neurotoxin gene and specific identification of neurotoxin types B, E, and F // J. Clin. Microbiol. 1993. V. 31. № 9. Р. 2255–2262.

5. Dahlenborg M., Borch E., Radstrom P. Development of a combined selection and enrichment PCR procedure for Clostridium botulinum types B, E, and F and its use to determine prevalence in fecal samples from slaughtered pigs // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. № 10. Р. 4781–4788.

6. Fach P., Gibert M., Griffais R., Guillou J.P., Popoff M.R. PCR and gene probe identification of botulinum neurotoxin A-, B-, E-, F-, and G-producing Clostridium spp. and evaluation in food samples // Appl. Environ. Microbiol. 1995. V. 61. № 1. Р. 389–392.

7. Akbulut D., Grant K.А., McLauchlin J. Development and application of Real-Time PCR assays to detect fragments of the Clostridium botulinum types A, B, and E neurotoxin genes for investigation of human foodborne and infant botulism // Foodborne Pathog Dis. 2004. V. 1. № 4. P. 247–257.

8. Hill B.J., Skerry J.C., Smith T.J., Arnon S.S., Douek D.C. Universal and specific quantitative detection of botulinum neurotoxin genes // BMC Microbiology. 2010. № 10. Р. 267-304. DOI:10.1186/1471-2180-10-267.

9. Kitamura M., Sakaguchi S., Sakaguchi G. Purification and some properties of Clostridium botulinum type-E toxin // Biochim. Biophys. Acta. 1968. V. 168. № 2. Р. 207–217.

10. Kozaki S., Sakaguchi S., Sakaguchi G. Purification and some properties of progenitor toxins of Clostridium botulinum type B // Infect. Immun. 1974. V. 10. № 4. Р. 750–756.

11. Hill K.K., Xie G., Foley B.T., Smith T.J. Genetic diversity within the botulinum neurotoxin-producing bacteria and their neurotoxins // Toxicon. 2015. V. 107. P. 2–8. DOI: 10.1016.