Генетическое конструирование рекомбинантого штамма Bacillus subtilis, продуцирующего протективный антиген сибиреязвенного микроба

Сибирская язва является особо опасным зооантропонозным заболеванием, которое характеризуется тяжестью течения и высокой летальностью. Споры Bacillus anthracis обладают способностью длительно сохраняться в окружающей среде. На эндемичной территории сибиреязвенная инфекция может стать причиной массового заболевания людей и сельскохозяйственных животных. Кроме того, существует угроза применения биологических средств на основе возбудителя сибирской язвы террористическими организациями. Эпидемиологическое благополучие по сибирской язве напрямую зависит от вакцинации восприимчивых животных и населения групп риска. Многие из существующих сибиреязвенных вакцинных штаммов характеризуются низким уровнем продукции протективного антигена и высокой реактогенностью. Перспективным направлением создания вакцинных препаратов нового поколения является клонирование отдельных детерминант иммуногенности сибиреязвенного микроба в гомо­ и гетерологичных живых системах с целью создания высокоэффективных продуцентов протективного антигена B. anthracis. Цель работы заключалась в проведении исследований по получению рекомбинантного штамма Bacillus subtilis, продуцирующего протективный антиген сибиреязвенного микроба, перспективный для использования в технологии химических сибиреязвенных вакцин. В статье представлены результаты исследований по получению рекомбинантного штамма B. subtilis. На основе челночного вектора рHТ43 сконструирована плазмида pНТ43PA, содержащая ген pag синтеза протективного антигена сибиреязвенного микроба и стабильно функционирующая в клетках рекомбинантного штамма Amy21(pHT43РА) B. subtilis. В ходе исследований установлено, что микробные клетки рекомбинантного штамма Amy21(pHT43РА) B. subtilis обеспечивают продукцию иммунологически активного протективного антигена в количестве, не уступающем сибиреязвенным вакцинным штаммам. Полученные в ходе работ данные, а также безопасность, неприхотливость, изученность В. subtilis позволяют предложить данный рекомбинантный штамм для дальнейшего исследования в качестве продуцента сибиреязвенного протективного антигена, перспективного для использования в качестве химической составляющей сибиреязвенных вакцин.

1. Бургасов П.Н., Черкасский Б.Л., Марчук Л.М. и др. Сибирская язва. М.: Медицина, 1970.

2. Бондарев В.П., Филиппов А.В., Дармов И.В. и др. Разработка иммуноферментной моноклональной тест-системы для обнаружения протективного антигена Bacillus anthracis // Проблемы особо опасных инфекций. 2007. T. 93. С 66–69.

3. Онищенко Г.Г., Васильев Н.Т., Литусов Н.В. и др. Сибирская язва: актуальные аспекты микробиологии, эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики. М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999.

4. Онищенко Г.Г. Инфекционные болезни – важнейший фактор биоопасности // Эпидемология и инфекционные болезни. 2003. № 3. С. 4–16.

5. Кутырев В.В., Смирнова Н.И. Генодиагностика и молекулярное типирование чумы, холеры и сибирской язвы // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2003. № 1. С. 6–14.

6. Онищенко Г.Г., Федоров Ю.М., Тихонов Н.Г. и др. Противодействие биотерроризму как новая проблема эпидемиологии // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2003. № 2. С. 4–6.

7. Inglesby T.V., Henderson D., Bartlett J.G. et al. Anthrax as a Biological Weapon. Updated recommendations for management // JAMA. 2002. V. 287. P. 2236–2252.

8. Pile J.C., Malone J.D., Eitzen E.M. et al. Anthrax as a Potential Biological Warfare Agent // Arch. int. Med. 1998. V. 158. P. 429–434.

9. Васильев Н.Т., Пименов Е.В., Кожухов В.В. и др. Перспективы создания сибиреязвенных вакцин нового поколения // Иммунология. 1999. № 3. С. 5–8.

10. Mikesell P., Ivins В., Ristroph J. Evidence for plasmid-mediated toxin production in Bacillus anthracis // Infect. Immun. 1983. V. 39. P. 371–376.

11. Okinaka R., Cloud K., Hampton O. et al. Sequence and organization of pX01, the large Bacillus anthracis plasmid harboring the anthrax toxin genes // J. Bacteriol. 1999. V. 181. P. 6509–6515.

12. Klimpel K.R., Molloy S.S., Thomas G., Leppla S.H. Anthrax toxin protective antigen is activated by a cell surface protease with the sequence specificity and catalytic properties of furin // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 10277–10281.

13. Leppla S.H. The anthrax toxin complex // Sourcebook of Bacterial Protein Toxins / Ed. Alouf J.F., Freer J.H. London: Academic Press, 1991. P. 277–302.

14. Vodkin M., Leppla S. Cloning of the protective antigen gene of Bacillus anthracis // Cell. 1983. V. 34. P. 693–697.

15. Алимов А.П., Павлов В.М. Патент РФ на изобретение № 2110575. Рекомбинантная плазмидная ДНК pro PF5, определяющая синтез капсульного антигена F1 возбудителя чумы и протективного антигена возбудителя сибирской язвы, и способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pro PF5 // Бюллетень № 13 от 10.05.1998.

16. Тедиков В.М., Добрица А.П. Клонирование и экспрессия детерминанты протективного антигена Bacillus anthracis в клетках Escherichia coli, Ваcillus subtilis и Bacillus anthracis // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1993. № 2. С. 13–16.

17. Chauhan V., Singh A., Waheed S. et al. Constitutive expression of protective antigen gene of Bacillus anthracis in Escherichia coli // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. V. 283. P. 308–315.

18. Coulson N.M., Fulop M., Titball R.W. Bacillus anthracis protective antigen, expressed in Salmonella typhimurium SL3261, affords protection against anthrax spore challenge // Vaccine. 1994. V. 12. P. 1395–1401.

19. Zegers N, Kluter E., van Der Stap H. et al. Expression of the protective antigen of Bacillus anthracis by Lactobacillus casei: Towards the development of an oral vaccine against anthrax // J. Appl. Microbiol. 1999. V. 87. P. 309–314.

20. Pavlov V., Tedikov V., Mokrievich A. Cloning of pXOI and pag-gene of Bacillus anthracis in Francisella tularensis // International Workshop on Anthrax, 19-21 September 1995. Winchester, England. 1995. P. 108–109.

21. Baillie L. W. J., Moir A., Manchee R. The expression of the protective antigen Bacillus anthracis in Bacillus subtilis // J. Appl. Microbiol. 1998. Vol. 84. P. 741– 746.

22. Cohen S., Mendelson L., Altboum Z. et al. Attenuated nontoxinogenic and nonencapsulated recombinant Bacillus anthracis spore vaccines protect against anthrax // Infect. Immun. 2000. V. 68. P. 4549–4558.

23. Ivins В.E., Welkos S.L. Cloning and expression of the B. anthracis protective antigen in B. subtilis // Infect. Immun. 1986. V. 54. P. 537–542.

24. Barnard J.P., Friedlander A.M. Vaccination against anthrax with attenuated recombinant strains of Bacillus anthracis that produce protective antigen // Infect. Immun. 1999. V. 67. P. 562–567.

25. Клонирование ДНК. Методы / Под ред. Гловера Д. Пер. с англ. М.: Мир,1988.

26. Экспериментально-производственный регламент № 862-99 производства вакцины сибиреязвенной комбинированной жидкой и сухой для подкожного применения. Киров, 1999.

27. Bacillus subtilis Expression Vectors Product Information and Instructions, 2005.

28. Молекулярная клиническая диагностика. Методы / Под ред. Херрингтона С., Макги Дж. Пер. с англ. М.: Мир, 1999.

29. Маниатис Т., Фрич Э., Самбрук Дж. Молеку