nbsprotВестник войск РХБ защитыJournal of NBC Protection Corps2587-57283034-279127 Научный центр10.35825/2587-5728-2021-5-3-236-246boyzhznbsprot-68Research ArticleБиологическая безопасность и защита от биологических угрозBiological Security and Protection against Biological ThreatsСовременные подходы к решению задач по подготовке проб к анализу методом полимеразной цепной реакцииCurrent State of Method Development for PCR Sample PeparationsТихвинскийМ. С.TikhvinskiyM. S.

Тихвинский Михаил Сергеевич. Начальник группы научно-исследовательского отдела, канд. биол. наук.

610000, г. Киров, Октябрьский проспект, д. 119

Mikhail Sergeevich Tikhvinskiy. Chief Group of the Scientific and Research Department. Candidate of Biological Sciences.

Oktyabrsky Avenue 119, Kirov 610000

23527@mil.ruВоробьевА. А.VorobiovA. A.

Воробьев Алексей Анатольевич. Ведущий научный сотрудник научно-исследовательского отдела, д-р. биол. наук.

610000, г. Киров, Октябрьский проспект, д. 119

Aleksey Anatolievich Vorobiov. Leading Researcher of the Scientific and Research Department. Doctor of Biological Sciences.

Oktyabrsky Avenue 119, Kirov 610000

23527@mil.ruКибиревЯ. А.KibirevYa. A.

Кибирев Ярослав Александрович. Начальник научно-исследовательского отдела, канд. биол. наук.

610000, г. Киров, Октябрьский проспект, д. 119

Yaroslav Aleksandrovich Kibirev. Chief of the Scientific and Research Department. Candidate of Biological Sciences.

Oktyabrsky Avenue 119, Kirov 610000

23527@mil.ruУсенкоГ. С.UsenkoG. S.

Усенко Геннадий Сергеевич. Старший научный сотрудник научно-исследовательского отдела.

610000, г. Киров, Октябрьский проспект, д. 119

Gennadii Sergeevich Usenko. Senior Researcher of the Scientific and Research Department.

Oktyabrsky Avenue 119, Kirov 610000

23527@mil.ruКозловА. И.KozlovA. I.

Козлов Артем Игоревич. Младший научный сотрудник научно-исследовательского отдела, канд. биол. наук.

610000, г. Киров, Октябрьский проспект, д. 119

Artem Igorevich Kozlov. Junior researcher of the Scientific and Research Department. Candidate of Biological Sciences.

Oktyabrsky Avenue 119, Kirov 610000

23527@mil.ruИсуповС. Г.IsupovS. G.

Исупов Сергей Геннадьевич. Заместитель начальника научно-исследовательского отдела – начальник группы, канд. мед. наук.

610000, г. Киров, Октябрьский проспект, д. 119

Sergey Gennadevich Isupov. Deputy Chief of the Scientific and Research Department. Candidate of Medical Sciences.

Oktyabrsky Avenue 119, Kirov 610000

23527@mil.ruФилиал федерального государственного бюджетного учреждения «48 Центральный научно- исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации (г. Киров)РоссияBranch Office of the Federal State Budgetary Establishment «48 Central Scientific Research Institute» of the Ministry of Defence of the Russian Federation (Kirov)Russian Federation20211506202153236246Copyright © Тихвинский М.С., Воробьев А.А., Кибирев Я.А., Усенко Г.С., Козлов А.И., Исупов С.Г., 20212021Тихвинский М.С., Воробьев А.А., Кибирев Я.А., Усенко Г.С., Козлов А.И., Исупов С.Г.Tikhvinskiy M.S., Vorobiov A.A., Kibirev Y.A., Usenko G.S., Kozlov A.I., Isupov S.G.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.nbsprot.ru/jour/article/view/68

Чувствительность, специфичность и воспроизводимость молекулярно-генетических методов анализа во многом зависит от качества предварительной подготовки анализируемых образцов. В ходе пробоподготовки решаются задачи обеззараживания патогенного материала, лизирования клеточных мембран, удаления соединений, и примесей ингибирующих полимеразную цепную реакцию (ПЦР), а также концентрирования нуклеиновых кислот. Цель работы – выбор современных подходов к подготовке проб к анализу методом ПЦР. Среди многообразия различных способов подготовки проб наибольшее распространение получили методы, основанные на химическом лизисе клеточных мембран с применением хаотропных соединений, с последующей очисткой нуклеиновых кислот твердофазной экстракцией с применением магнитных частиц. Этот подход реализован как в коммерческих наборах реагентов для ручной пробоподготовки, так и в различных автоматизированных системах для выделения нуклеиновых кислот. Анализ серийно выпускаемых станций для выделения нуклеиновых кислот, показал, что их технические характеристики схожи: продолжительность одного цикла выделения 40–90 мин; Объем анализируемых проб – от 0,1 до 2,0 мл; количество одновременно обрабатываемых проб max – 96, min – 8. Метод выделения нуклеиновой кислоты – магнитные частицы. Основные различия заключаются по виду анализируемых образцов, и технологий лизиса исследуемого материала и экстракции ДНК. Наш опыт применения содержащих магнитные частицы наборов для выделения нуклеиновых кислот, как в стационарных лабораториях, так и в полевых условиях, в частности, при эксплуатации многофункционального мобильного модульного комплекса «Сыч», подтверждает эффективность и надежность этой технологии. Дальнейшее развитие и совершенствование аппаратурного обеспечения таких работ будет, очевидно, направлено на миниатюризацию оборудования, разработку полевых портативных автоматических станций выделения нуклеиновых кислот, а также интеграцию процесса подготовки проб и их анализа методом ПЦР в одном устройстве.

The sensitivity, specificity and reproducibility of molecular genetic methods of analysis largely depend on the quality of the preliminary preparation of the analyzed samples. During the sample preparation, the tasks of disinfecting pathogenic material, lysing cell membranes, removing compounds and impurities that inhibit the polymerase chain reaction (PCR), as well as concentrating nucleic acids are solved. The purpose of this work is to select modern approaches to sample preparation for the PCR. Among the variety of different methods of sample preparation, the most widespread are the methods based on chemical lysis of cell membranes using chaotropic compounds, followed by purification of nucleic acids by solid-phase extraction using magnetic particles. This approach is implemented both in commercial kits for manual sample preparation and in various automated systems for the isolation of nucleic acids. The analysis of commercially available stations for the isolation of nucleic acids shows that their technical characteristics are similar: the duration of one isolation cycle is 40–90 minutes; the volume of the analyzed samples is from 0.1 to 2.0 ml; the number of simultaneously processed samples max – 96, min – 8. The method of the nucleic acid isolation is the magnetic particles. The main differences are in the type of analyzed samples, and technologies for lysis of the test material and DNA extraction. Our experience in the use of magnetic particle kits for the isolation of nucleic acids, both in stationary and in field laboratories confirms the effectiveness and reliability of this technology. Further development and improvement of the hardware for such work will, obviously, be aimed at miniaturizing the equipment, developing field portable automatic nucleic acid extraction stations, as well as integrating the process of sample preparation and analysis by PCR in one device.

автоматизированные системыидентификациякомплекс «Сыч»лизиснуклеиновые кислотыпатогеныподготовка пробполимеразная цепная реакцияэкстракцияautomated systemsidentificationlysisnucleic acidspathogenssample preparationpolymerase chain reactionextractionReferencesBloomfield M., Balm M., Blackmore T. Molecular testing for viral and bacterial enteric pathogens: gold standard for viruses, but don’t let culture go just yet? // Pathology. 2015. V. 47. P. 227-233. https://doi.org/10.1097/PAT.0000000000000233Bloomfield M., Balm M., Blackmore T. Molecular testing for viral and bacterial enteric pathogens: gold standard for viruses, but don’t let culture go just yet? // Pathology. 2015. V. 47. P. 227-233. https://doi.org/10.1097/PAT.0000000000000233Abayasekara L., Perera J., Chandrasekharan V. et al. Detection of bacterial pathogens from clinical specimens using conventional microbial culture and 16S metagenomics: a comparative study // BMC Infect. Dis. 2017. V. 17. Р. 631. https://doi.org/10.1186/s12879-017-2727-8Abayasekara L., Perera J., Chandrasekharan V. et al. Detection of bacterial pathogens from clinical specimens using conventional microbial culture and 16S metagenomics: a comparative study // BMC Infect. Dis. 2017. V. 17. Р. 631. https://doi.org/10.1186/s12879-017-2727-8Murphy J., Bustin S. Reliability of real-time reverse-transcription PCR in clinical diagnostics: gold standard or substandard? // Expert Rev. Mol. Diagn. 2009. V. 9. P. 187–197. https://doi.org/10.1586/14737159.9.2.187Murphy J., Bustin S. Reliability of real-time reverse-transcription PCR in clinical diagnostics: gold standard or substandard? // Expert Rev. Mol. Diagn. 2009. V. 9. P. 187–197. https://doi.org/10.1586/14737159.9.2.187Кибирев Я.А., Бурлачук С.Е., Грудцына А.С. и др. Методы идентификации возбудителей опасных и особо опасных инфекционных заболеваний, основанные на анализе нуклеиновых кислот // Вестник войск РХБ защиты. 2018. Т. 2. № 4. С. 22–35.Kibirev Ya.A., Burlachuk S.E., Grudcina A.S. et al. Methods for identification of causative agents of dangerous and particularly dangerous infections based on the analysis of nucleic acids // Journal of NBC Protection Corps. 2018. V. 2 № 4. P. 22–35. (in Russian).Demeke T., Jenkins R. Influence of DNA extraction methods, PCR inhibitors and quantification methods on real-time PCR assay of biotechnologyderived traits // Anal. Bioanal. Chem. 2010. V. 396. P. 1977-1990. https://doi.org/10.1007/s00216-009-3150-9Demeke T., Jenkins R. Influence of DNA extraction methods, PCR inhibitors and quantification methods on real-time PCR assay of biotechnologyderived traits // Anal. Bioanal. Chem. 2010. V. 396. P. 1977-1990. https://doi.org/10.1007/s00216-009-3150-9Maja Sidstedt M.,Rådström P., Hedman J. PCR inhibition in qPCR, dPCR and MPS—mechanisms and solutions // Anal. Bioanal. Chem. 2020. V. 412. P. 2009– 2023. https://doi.org/10.1007/s00216-020-02490-2Maja Sidstedt M.,Rådström P., Hedman J. PCR inhibition in qPCR, dPCR and MPS—mechanisms and solutions // Anal. Bioanal. Chem. 2020. V. 412. P. 2009– 2023. https://doi.org/10.1007/s00216-020-02490-2Шапхаев Э.Г., Цыренов В.Ж., Чебунина Е.И. Основы биотехнологии. Издательство ВСГТУ. 2005. 94 с.Shaphaev A.G., Tsirenov V., Chebuniba E.I. Fundamentals of Biotechnology. Publishing office VSGTU. 2005. 94 pp. (in Russian).Wink M. An introduction to molecular biotechnology: molecular fundamentals, methods and application in modern biotechnology. Wiley-VCH. Weinheim. Germany. 2006.Wink M. An introduction to molecular biotechnology: molecular fundamentals, methods and application in modern biotechnology. Wiley-VCH. Weinheim. Germany. 2006.Ali N., de Rampazzo R., Costa A. et al. Current nucleic acid extraction methods and their implications to point-of-care diagnostics // BioMed Res. Int. 2017. V. 2017. 9306564. https://doi.org/10.1155/2017/9306564Ali N., de Rampazzo R., Costa A. et al. Current nucleic acid extraction methods and their implications to point-of-care diagnostics // BioMed Res. Int. 2017. V. 2017. 9306564. https://doi.org/10.1155/2017/9306564Hedman J., Rådström P. Overcoming inhibition in realtime diagnostic PCR // Meth. Mol. Biol. 2013. V. 943. P. 17–48. https://doi.org/10.1007/978-1-60327-353-4_2Hedman J., Rådström P. Overcoming inhibition in realtime diagnostic PCR // Meth. Mol. Biol. 2013. V. 943. P. 17–48. https://doi.org/10.1007/978-1-60327-353-4_2Sidstedt M., Hedman J., Romsos E.L. et al. Inhibition mechanisms of hemoglobin, immunoglobulin G, and whole blood in digital and real-time PCR // Anal. Bioanal. Chem. 2018. V. 410. P. 2569–2583. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0931-zSidstedt M., Hedman J., Romsos E.L. et al. Inhibition mechanisms of hemoglobin, immunoglobulin G, and whole blood in digital and real-time PCR // Anal. Bioanal. Chem. 2018. V. 410. P. 2569–2583. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0931-zWilson I. Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification // Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63. P. 3741–3751.Wilson I. Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification // Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63. P. 3741–3751.Rådström P., Knutsson R., Wolffs P., et al. PrePCR processing: Strategies to generate PCR-compatible samples // Mol. Biotechnol. 2004. V. 26. P. 133–146. https://doi.org/10.1385/MB:26:2:13Rådström P., Knutsson R., Wolffs P., et al. PrePCR processing: Strategies to generate PCR-compatible samples // Mol. Biotechnol. 2004. V. 26. P. 133–146. https://doi.org/10.1385/MB:26:2:13Антонова О.С., Корнева Н.А., Белов Ю.В. и др. Эффективные методы выделения нуклеиновых кислот для проведения анализов в молекулярной биологии (Обзор) // Научное Приборостроение. 2010. Т. 20. № 1. С. 3–9.Antonova O.S., Korneva N.A., Belov Yu.V. et al. Methods of nucleic acids purification and separation in molecular biology (Review) // Nauchnoe Priborostroenie. 2010. V. 20. P. 3-9. (in Russian).Eslami G., Khalatbari-Limaki S., Ehrampoush M.H. et al. Comparison of three different DNA extraction methods for Linguatula serrata as a food born pathogen // Iranian J. Parasitol. 2017. V. 12. P. 236-242.Eslami G., Khalatbari-Limaki S., Ehrampoush M.H. et al. Comparison of three different DNA extraction methods for Linguatula serrata as a food born pathogen // Iranian J. Parasitol. 2017. V. 12. P. 236-242.Tan S.C., Yiap B.C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present // J. Biomed. Biotechnol. 2009. V. 2009. 574398. https://doi.org/10.1155/2009/574398.Tan S.C., Yiap B.C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present // J. Biomed. Biotechnol. 2009. V. 2009. 574398. https://doi.org/10.1155/2009/574398.Oskam C.L., Haile J., McLay E. et al. Fossil avian eggshell preserves ancient DNA // Proc. R. Soc. B. 2010. V. 277. P. 1991–2000. http://doi.org/10.1098/rspb.2009.2019Oskam C.L., Haile J., McLay E. et al. Fossil avian eggshell preserves ancient DNA // Proc. R. Soc. B. 2010. V. 277. P. 1991–2000. http://doi.org/10.1098/rspb.2009.2019Грачев М.А., Кузнецова С.Ю., Щербакова Т.А. Метод выделения высокоочищенной ДНК для использования в полимеразной цепной реакции // Молекулярная биология. 2006. Т. 40. № 1. С. 180-183.Grachev M.A., Kuznetsova S.Yu., Sherbakova T.A. A method for the isolation of pure DNA for PCR // Molecular Biology. 2006. V. 40. P. 159-161. (in Russian).Zähringer H. Don’t lose the thread. Product survey: Manual DNA extraction kits // Lab Times. 2012. V. 6, P. 52–56. URL: https://docplayer.net/53735876-Pure-dnadevoid-of-impurities-from.htm.Zähringer H. Don’t lose the thread. Product survey: Manual DNA extraction kits // Lab Times. 2012. V. 6, P. 52–56. URL: https://docplayer.net/53735876-Pure-dnadevoid-of-impurities-from.htm.Doebler R.W., Erwin B., Hickerson A. et al. Continuous-flow, rapid lysis devices for biodefense nucleic acid diagnostic systems // JALA. 2009. V. 14. P. 119-125. https://doi.org/10.1016/j.jala.2009.02.010Doebler R.W., Erwin B., Hickerson A. et al. Continuous-flow, rapid lysis devices for biodefense nucleic acid diagnostic systems // JALA. 2009. V. 14. P. 119-125. https://doi.org/10.1016/j.jala.2009.02.010Chacon-Cortes D., Griffiths L. Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples: current perspectives // J. Biorepository Science for Applied Medicine, 2014. V. 2. P. 1–9. https://doi.org/10.2147/BSAM.S46573Chacon-Cortes D., Griffiths L. Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples: current perspectives // J. Biorepository Science for Applied Medicine, 2014. V. 2. P. 1–9. https://doi.org/10.2147/BSAM.S46573Archer M. J., Lin B., Wang Z. et al. Magnetic bead-based solid phase for selective extraction of genomic DNA // Anal. Biochem. 2006. V. 355. P. 285-297. https://doi.org/10.1016/j.ab.2006.05.005Archer M. J., Lin B., Wang Z. et al. Magnetic bead-based solid phase for selective extraction of genomic DNA // Anal. Biochem. 2006. V. 355. P. 285-297. https://doi.org/10.1016/j.ab.2006.05.005Thatcher S.A. DNA/RNA preparation for molecular detection // Clin. Chem. 2015. V. 61. P. 89–99. https://doi.org/10.1373/clinchem.2014.221374Thatcher S.A. DNA/RNA preparation for molecular detection // Clin. Chem. 2015. V. 61. P. 89–99. https://doi.org/10.1373/clinchem.2014.221374Berensmeier S. Magnetic particles for the separation and purification of nucleic acids // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. V. 73. P. 495–504. https://doi.org/10.1007/s00253-006-0675-0Berensmeier S. Magnetic particles for the separation and purification of nucleic acids // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. V. 73. P. 495–504. https://doi.org/10.1007/s00253-006-0675-0Phillips K., McCallum N., Welch L. A comparison of methods for forensic DNA extraction: Chelex-100® and the QIAGEN DNA Investigator Kit // Forensic Sci. Int. Genet. 2012. V. 6. P. 282–285. https://doi.org/10.1016/j.fsigen.2011.04.018Phillips K., McCallum N., Welch L. A comparison of methods for forensic DNA extraction: Chelex-100® and the QIAGEN DNA Investigator Kit // Forensic Sci. Int. Genet. 2012. V. 6. P. 282–285. https://doi.org/10.1016/j.fsigen.2011.04.018Schrader C., Schielke A., Ellerbroek L. et al. PCR inhibitors—occurrence, properties and removal // J. App. Microb. 2012. V. 113. P. 1014–1026. https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2012.05384.xSchrader C., Schielke A., Ellerbroek L. et al. PCR inhibitors—occurrence, properties and removal // J. App. Microb. 2012. V. 113. P. 1014–1026. https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2012.05384.xde Boer R, Peters R, Gierveld S. et al. Improved detection of microbial DNA after bead-beating before DNA isolation // J. Microbiol. Methods. 2010. V. 80. P. 209–211. https://doi.org/10.1016/j.mimet.2009.11.009de Boer R, Peters R, Gierveld S. et al. Improved detection of microbial DNA after bead-beating before DNA isolation // J. Microbiol. Methods. 2010. V. 80. P. 209–211. https://doi.org/10.1016/j.mimet.2009.11.009Verheyen J., Kaiser R., Bozic M. et al. Extraction of viral nucleic acids: comparison of 5 automated nucleic acid extraction platforms // J. Clin. Virol. 2012. V. 54. P. 255–259. https://doi.org/0.1016/j.jcv.2012.03.008Verheyen J., Kaiser R., Bozic M. et al. Extraction of viral nucleic acids: comparison of 5 automated nucleic acid extraction platforms // J. Clin. Virol. 2012. V. 54. P. 255–259. https://doi.org/0.1016/j.jcv.2012.03.008Shipley M., Koehler J., Kulesh D. et al. Comparison of nucleic acid extraction platforms for detection of select biothreat agents for use in clinical resource limited settings // J. Microbiol. Methods. 2012. V. 91. P. 179–183. https://doi.org/10.1016/j.mimet.2012.06.008Shipley M., Koehler J., Kulesh D. et al. Comparison of nucleic acid extraction platforms for detection of select biothreat agents for use in clinical resource limited settings // J. Microbiol. Methods. 2012. V. 91. P. 179–183. https://doi.org/10.1016/j.mimet.2012.06.008Mauk M., Liu C., Sadik M. et al. Microfluidic devices for nucleic acid (NA) isolation, isothermal NA amplification, and real-time detection // Methods Mol. Biol. 2015. V. 1256. P. 15–40. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-2172-0_2Mauk M., Liu C., Sadik M. et al. Microfluidic devices for nucleic acid (NA) isolation, isothermal NA amplification, and real-time detection // Methods Mol. Biol. 2015. V. 1256. P. 15–40. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-2172-0_2Saeed M., Ahmad M., Iram S. et al. GeneXpert technology. A breakthrough for the diagnosis of tuberculous pericarditis and pleuritis in less than 2 hours // Saudi Med. J. 2017. V. 38. No. 7. P. 699–705. https://doi.org/10.15537/smj.2017.7.17694Saeed M., Ahmad M., Iram S. et al. GeneXpert technology. A breakthrough for the diagnosis of tuberculous pericarditis and pleuritis in less than 2 hours // Saudi Med. J. 2017. V. 38. No. 7. P. 699–705. https://doi.org/10.15537/smj.2017.7.17694Poritz M., Blaschke A., Byington C. et al. FilmArray, an automated nested multiplex PCR system for multi-pathogen detection: development and application to respiratory tract infection // PLoS One. 2011. V. 6. e26047. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0026047Poritz M., Blaschke A., Byington C. et al. FilmArray, an automated nested multiplex PCR system for multi-pathogen detection: development and application to respiratory tract infection // PLoS One. 2011. V. 6. e26047. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0026047

The authors declare that there are no conflicts of interest present.