nbsprotВестник войск РХБ защитыJournal of NBC Protection Corps2587-57283034-279127 Научный центр10.35825/2587-5728-2025-9-4-345-369nbsprot-431Research ArticleПРОБЛЕМЫ СОБЛЮДЕНИЯ КОНВЕНЦИЙ ПО ЗАПРЕЩЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО И БИОЛОГИЧЕСКОГО ОРУЖИЯISSUES OF COMPLIANCE WITH CHEMICAL AND BIOLOGICAL WEAPONS CONVENTIONSСтруктурная идентификация и сравнительная оценка содержания метаболитов инкапаситанта BZ в моче и плазме крови крысStructural identification and comparative assessment of the content of BZ incapacitant metabolite in rat urine and blood plasmaКоваленкоИ. И.KovalenkoI. I.

Коваленко Ирина Игоревна. Младший научный сотрудник.

111024, г. Москва, проезд Энтузиастов, д. 19

Irina I. Kovalenko. Researcher.

Entuziastov Proezd, 19, Moscow 111024

27nc_l@mil.ruЯрлыченкоА. С.IarlychenkoA. S.

Ярлыченко Алексей Сергеевич. Младший научный сотрудник.

111024, г. Москва, проезд Энтузиастов, д. 19

Aleksey S. Iarlychenko. Researcher.

Entuziastov Proezd, 19, Moscow 111024

27nc_l@mil.ruСтавитскаяЯ. В.StavitskayaJ. V.

Ставитская Яна Вадимовна. Научный сотрудник.

111024, г. Москва, проезд Энтузиастов, д. 19

Jana V. Stavitskaya. Researcher.

Entuziastov Proezd, 19, Moscow 111024

27nc_l@mil.ruКолосоваН. А.KolosovaN. A.

Колосова Наталья Александровна. Старший научный сотрудник, канд.биол.наук.

111024, г. Москва, проезд Энтузиастов, д. 19

Nataliya A. Kolosova. Senior Researcher. PhD.

Entuziastov Proezd, 19, Moscow 111024

27nc_l@mil.ruРыбальченкоИ. В.RybalchenkoI. V.

Рыбальченко Игорь Владимирович. Главный научный сотрудник, д-р хим. наук.

111024, г. Москва, проезд Энтузиастов, д. 19

Igor V. Rybalchenko. Senior Researcher. Dr Sci. (Chem).

Entuziastov Proezd, 19, Moscow 111024

27nc_l@mil.ruhttps://orcid.org/0000-0002-5971-5989ГригорьевА. М.GrigoryevA. M.

Григорьев Андрей Михайлович. Старший научный сотрудник, д-р хим. наук.

111024, г. Москва, проезд Энтузиастов, д. 19

Andrej M. Grigoryev. Senior Researcher. Dr Sci. (Chem).

Entuziastov Proezd, 19, Moscow 111024

27nc_l@mil.ruФедеральное государственное бюджетное учреждение «27 Научный центр имени академика Н.Д. Зелинского» Министерства обороны Российской ФедерацииРоссия27 Scientific Center Named after Academician N.D. Zelinsky of the Ministry of Defence of Russian FederationRussian Federation20251601202694345369Copyright © Коваленко И.И., Ярлыченко А.С., Ставитская Я.В., Колосова Н.А., Рыбальченко И.В., Григорьев А.М., 20262026Коваленко И.И., Ярлыченко А.С., Ставитская Я.В., Колосова Н.А., Рыбальченко И.В., Григорьев А.М.Kovalenko I.I., Iarlychenko A.S., Stavitskaya J.V., Kolosova N.A., Rybalchenko I.V., Grigoryev A.M.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.nbsprot.ru/jour/article/view/431

Основные моменты- в зоне специальной военной операции отмечается применение украинскими вооруженными и террористическими формированиями нелетальных отравляющих веществ, что является нарушением Конвенции о запрещении разработки, производства, накопления и применения химического оружия и его уничтожении (КЗХО);- разработан хромато-масс-спектрометрический способ, позволяющий установить факт отравления BZ и его аналогами по их метаболитам в моче и плазме крови.Актуальность. Начиная с 2022 г., в зоне СВО дважды фиксировались случаи обнаружения вещества EA-3167, структурного и функционального аналога инкапаситанта BZ, включенного в Список 2 КЗХО. Отмечены случаи отравления российских военнослужащих. Несмотря на давнее открытие самого BZ, сведения о его метаболизме и возможных маркерах отравления, опубликованные в открытых источниках, крайне неполны и недостаточны.Цель работы – обнаружение и структурная идентификация метаболитов BZ в моче и плазме крови крыс; оценка относительного содержания BZ и его метаболитов.Материалы и методы. Жидкостная и газовая хроматография-масс-спектрометрия высокого разрешения. Оценка относительного содержания метаболитов BZ проводилась исходя из величин интенсивностей (площадей) пиков метаболитов в условиях жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии высокого разрешения. Определялись характеристики метаболитов, характерных для отравления BZ.Результаты. В моче и плазме крови крыс предположительно идентифицировали более 40 метаболитов BZ, образованных в результате окислительных и (частично) гидролитических модификаций исходной молекулы. Структуры окисленных метаболитов фазы I содержали до четырех дополнительных атомов кислорода, входящих в состав гидроксильных групп на фенильных остатках и N-оксида. Метаболиты фазы I подвержены интенсивному конъюгированию с образованием O-метильных и глюкуронидированных форм, а также их комбинаций. Было найдено, что содержание ряда метаболитов в моче (в том числе глюкуронида дигидроксилированного метилированного метаболита) увеличивалось вплоть до 24 ч после экспонирования. Неизмененный BZ присутствовал в моче крыс лишь в небольших концентрациях.Выводы. Для подтверждения отравления BZ методом хроматографии-масс-спектрометрии наиболее удобны моногидроксилированные, N-окисленные и дигидроксилированные метилированные формы. При значительном времени после отравления рекомендуется обнаружение глюкуронидов моногидроксилированных и дигидроксилированных метилированных метаболитов.Практическая значимость работы. Разработанный подход позволяет объективно подтверждать факт отравления инкапаситантом BZ и его аналогами по стабильным метаболитам в биосредах. Результаты работы имеют важное прикладное значение для химико-аналитического обеспечения контроля за соблюдением КЗХО и судебно-медицинской экспертизы.

Highlights- use of non-lethal chemical agents by Ukrainian armed and terrorist formations has been documented in the Special Military Operation zone, constituting a violation of the Chemical Weapons Convention;- a chromatographic-mass spectrometric method has been developed to confirm exposure to BZ and its analogs through identification of their metabolites in urine and blood plasma.Relevance. Since 2022, two instances of EA-3167 detection have been recorded in the SMO zone - a structural and functional analog of the incapacitating agent BZ listed in Schedule 2 of the CWC. Cases of intoxication among Russian military personnel have been reported. Despite BZ being known for decades, information about its metabolism and potential exposure markers in open sources remains extremely limited and insufficient.Purpose of the study is to detect and structurally identify BZ metabolites in rat urine and blood plasma; to assess the relative content of BZ and its metabolites.Materials and Methods. High-resolution liquid and gas chromatography-mass spectrometry. Evaluation of relative metabolite content was based on peak intensity (area) measurements under HPLC-HRMS conditions. Characteristics of metabolites specific to BZ exposure were determined.Results. Over 40 BZ metabolites formed through oxidative and (partially) hydrolytic modifications.Conclusion. For of the parent molecule were tentatively identified in rat urine and plasma. Structures of Phase I oxidized metabolites contained up to four additional oxygen atoms incorporated as hydroxyl groups on phenyl residues and N-oxide. Phase I metabolites undergo intensive conjugation forming O-methylated and glucuronidated forms, and their combinations. Levels of several metabolites in urine (including glucuronide of dihydroxylated methylated metabolite) increased up to 24 hours post-exposure. Unchanged BZ was present in rat urine only in minor concentrations.forensic confirmation of BZ exposure using chromatography-mass spectrometry, monohydroxylated, N-oxidized, and dihydroxylated methylated forms are most suitable. When significant time has passed after exposure, detection of glucuronides of monohydroxylated and dihydroxylated methylated metabolites is recommended.Practical significance of the work. The developed approach allows for the objective confirmation of poisoning by the incapacitating agent BZ and its analogues through the detection of stable metabolites in biological samples. The results are of high practical importance for chemical-analytical support in monitoring compliance with the Chemical Weapons Convention and for forensic medical examination.

BZEA-3167газовая хроматомасс-спектрометрияжидкостная хромато-масс-спектрометрияинкапаситантыметаболитыкрысыспециальная военная операцияточные массыaccurate massesBZEA-3167gas chromatography-mass spectrometryincapacitantliquid chromatographymass spectrometrymetabolitesratФедеральное государственное бюджетное учреждение «27 Научный центр имени академика Н.Д. Зелинского» Министерства обороны Российской Федерации27 Scientific Center Named after Academician N.D. Zelinsky of the Ministry of Defence of Russian FederationReferencesAnczyk E, Maćkowiak AM. (eds.) Psychoactive substances, drugs and altered states of consciousness: cultural perspectives. Katowice: Sacrum Publishing House and Authors; 2016. 204 p.Anczyk E, Maćkowiak AM. (eds.) Psychoactive substances, drugs and altered states of consciousness: cultural perspectives. Katowice: Sacrum Publishing House and Authors; 2016. 204 p.Gibson RE, Rzeszotarski WJ, Eckelman WC, Jagoda EM, Weckstein DJ, Reba RC. Differences in affinities of muscarinic acetylcholine receptor antagonists for brain and heart receptors. Biochem Pharmacol. 1983;32(12):1851–56. https://doi.org/10.1016/0006-2952(83)90049-7Gibson RE, Rzeszotarski WJ, Eckelman WC, Jagoda EM, Weckstein DJ, Reba RC. Differences in affinities of muscarinic acetylcholine receptor antagonists for brain and heart receptors. Biochem Pharmacol. 1983;32(12):1851–56. https://doi.org/10.1016/0006-2952(83)90049-7Palmer WG. Field-Water Quality Standards for BZ. Technical Report. U S Army Biomedical Research & Development Laboratory. Fort Detrick, 1990. URL: https://apps.dtic.mil/sti/citations/ADA220896 (дата обращения: 21.09.2025)Palmer WG. Field-Water Quality Standards for BZ. Technical Report. U S Army Biomedical Research & Development Laboratory. Fort Detrick, 1990. URL: https://apps.dtic.mil/sti/citations/ADA220896 (дата обращения: 21.09.2025)Ketchum JS. Chemical Warfare Secrets Almost Forgotten. A Personal Story of Medical Testing of Army Volunteers with Incapacitating Chemical Agents During the Cold War (1955-1975). Santa Rosa: ChemBooks Inc.; 2006. 360 p.Ketchum JS. Chemical Warfare Secrets Almost Forgotten. A Personal Story of Medical Testing of Army Volunteers with Incapacitating Chemical Agents During the Cold War (1955-1975). Santa Rosa: ChemBooks Inc.; 2006. 360 p.Rzeszotarski WJ, Gibson RE, Eckelman WC, Simms DA, Jagoda EM, Ferreira NL, et al. Analogues of 3-quinuclidinyl benzilate. J Med Chem. 1982;25(9):1103-06. https://doi.org/10.1021/jm00351a020Rzeszotarski WJ, Gibson RE, Eckelman WC, Simms DA, Jagoda EM, Ferreira NL, et al. Analogues of 3-quinuclidinyl benzilate. J Med Chem. 1982;25(9):1103-06. https://doi.org/10.1021/jm00351a020Ball JC. Review article. Dual use research of concern: derivatives of 3-quinuclidinyl benzilate (BZ). Mil Med Sci Lett (Voj Zdrav Listy). 2015;84(1):2-41. https://doi.org/10.31482/mmsl.2015.001Ball JC. Review article. Dual use research of concern: derivatives of 3-quinuclidinyl benzilate (BZ). Mil Med Sci Lett (Voj Zdrav Listy). 2015;84(1):2-41. https://doi.org/10.31482/mmsl.2015.001Misik J, Korabecny J, Nepovimova E, Kracmarova A, Kassa J. Effects of novel tacrine-related cholinesterase inhibitors in the reversal of 3-quinuclidinyl benzilate-induced cognitive deficit in rats--Is there a potential for Alzheimer's disease treatment? Neurosci Lett. 2016;612:261-68.Misik J, Korabecny J, Nepovimova E, Kracmarova A, Kassa J. Effects of novel tacrine-related cholinesterase inhibitors in the reversal of 3-quinuclidinyl benzilate-induced cognitive deficit in rats--Is there a potential for Alzheimer's disease treatment? Neurosci Lett. 2016;612:261-68.Zhang JJ, Fu H, Lin R, Zhou J, Haider A, Fang W, et al. Imaging Cholinergic Receptors in the Brain by Positron Emission Tomography. J Med Chem. 2023;66(16):10889-916. https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.3c00573Zhang JJ, Fu H, Lin R, Zhou J, Haider A, Fang W, et al. Imaging Cholinergic Receptors in the Brain by Positron Emission Tomography. J Med Chem. 2023;66(16):10889-916. https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.3c00573Akashita G, Nakatani E, Tanaka S, Okura T. Development of simultaneous determination of dopamine 2, histamine 1, and muscarinic acetylcholine receptor occupancies by antipsychotics using liquid chromatography with tandem mass spectrometry. J Pharmacol Toxicol Methods. 2024;127: 107518.Akashita G, Nakatani E, Tanaka S, Okura T. Development of simultaneous determination of dopamine 2, histamine 1, and muscarinic acetylcholine receptor occupancies by antipsychotics using liquid chromatography with tandem mass spectrometry. J Pharmacol Toxicol Methods. 2024;127: 107518.Innis RB, Tune L, Rock R, Depaulo R, U'Prichard DC, Snyder SH. Tricyclic antidepressant radioreceptor assay. Eur J Pharmacol. 1979;58(4):473-77. https://doi.org/10.1016/0014-2999(79)90319-4Innis RB, Tune L, Rock R, Depaulo R, U'Prichard DC, Snyder SH. Tricyclic antidepressant radioreceptor assay. Eur J Pharmacol. 1979;58(4):473-77. https://doi.org/10.1016/0014-2999(79)90319-4Григорьев АМ, Фатеенков ВН. Современные психоактивные вещества и их обнаружение в биомедицинских пробах. Вестник войск РХБ защиты. 2022;6(4):320-341. https://doi.org/10.35825/2587-5728-2022-6-4-320-341Grigoryev AM, Fateenkov VN. Modern Psychoactive Substances and Their Detection in Biomedical Samples. Journal of NBC Protection Corps. 2022;6(4):320–41. EDN: EUKKMS (in Russian). https://doi.org/10.35825/2587-5728-2022-6-4-320-341Григорьев АМ, Яшкир ВА, Крылов ВИ, Колосова НА, Фатеенков ВН. Идентификация EA-3167, структурного аналога инкапаситанта BZ, в объектах, доставленных из зоны проведения специальной военной операции, и обнаружение его метаболитов в моче при экспонировании крыс. Вестник войск РХБ защиты. 2024;8(1):18-33. https://doi.org/10.35825/2587-5728-2024-8-1-18-33Grigoryev AM, Jashkir VA, Kryliv VI, Kolosova NA, Fateenkov VN. Identification of EA 3167, a Structural Analogue of the BZ Incapacitant, in Objects Delivered from the Zone of a Special Military Operation and Detection of Its Metabolites in Urine during Exposure of Rats. Journal of NBC Protection Corps. 2024;8(1):18–33. EDN:hrotqc (in Russian). https://doi.org/10.35825/2587-5728-2024-8-1-18-33Sng MT, Ng WF. In-situ derivatisation of degradation products of chemical warfare agents in water by solid-phase microextraction and gas chromatographic–mass spectrometric analysis. J Chromatogr. A. 1999;832(1-2):173-82. https://doi.org/10.1016/s0021-9673(98)00990-xSng MT, Ng WF. In-situ derivatisation of degradation products of chemical warfare agents in water by solid-phase microextraction and gas chromatographic–mass spectrometric analysis. J Chromatogr. A. 1999;832(1-2):173-82. https://doi.org/10.1016/s0021-9673(98)00990-xBlack RM, Muir B. Derivatisation reactions in the chromatographic analysis of chemical warfare agents and their degradation products. J Chromatogr A. 2003;1000(1-2):253-281. https://doi: 10.1016/s0021-9673(03)00183-3Black RM, Muir B. Derivatisation reactions in the chromatographic analysis of chemical warfare agents and their degradation products. J Chromatogr A. 2003;1000(1-2):253-281. https://doi: 10.1016/s0021-9673(03)00183-3Valdez CA, Leif RN, Vu AK, Salazar EP. Trocylation of 3-quinuclidinol, a key marker for the chemical warfare agent 3-quinuclidinyl benzilate, for its enhanced detection at low levels in complex soil matrices by electron ionization gas chromatography-mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 2021;35(15):e9123. https://doi.org/10.1002/rcm.9123Valdez CA, Leif RN, Vu AK, Salazar EP. Trocylation of 3-quinuclidinol, a key marker for the chemical warfare agent 3-quinuclidinyl benzilate, for its enhanced detection at low levels in complex soil matrices by electron ionization gas chromatography-mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 2021;35(15):e9123. https://doi.org/10.1002/rcm.9123Kuitunen ML, Dutoit JC, Siegenthaler P. Identification of acidic degradation products of chemical warfare agents by methylation with trimethylsilyldiazomethane and gas chromatography–mass spectrometry. J Anal Sci Technol. 2022;13(29):1-13. https://doi.org/10.1186/s40543-022-00338-1Kuitunen ML, Dutoit JC, Siegenthaler P. Identification of acidic degradation products of chemical warfare agents by methylation with trimethylsilyldiazomethane and gas chromatography–mass spectrometry. J Anal Sci Technol. 2022;13(29):1-13. https://doi.org/10.1186/s40543-022-00338-1Black RM, Read RW. Application of liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionisation mass spectrometry, and tandem mass spectrometry, to the analysis and identification of degradation products of chemical warfare agents. J Chromatogr A. 1997;759(1-2):79-92. http://dx.doi.org/10.1016/S0021-9673(96)00763-7Black RM, Read RW. Application of liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionisation mass spectrometry, and tandem mass spectrometry, to the analysis and identification of degradation products of chemical warfare agents. J Chromatogr A. 1997;759(1-2):79-92. http://dx.doi.org/10.1016/S0021-9673(96)00763-7Read RW, Black RM. Rapid screening procedures for the hydrolysis products of chemical warfare agents using positive and negative ion liquid chromatography–mass spectrometry with atmospheric pressure chemical ionization. J Chromatogr A. 1999;862(2):169-77. https://doi.org/10.1016/s0021-9673(99)00944-9Read RW, Black RM. Rapid screening procedures for the hydrolysis products of chemical warfare agents using positive and negative ion liquid chromatography–mass spectrometry with atmospheric pressure chemical ionization. J Chromatogr A. 1999;862(2):169-77. https://doi.org/10.1016/s0021-9673(99)00944-9Byrd GD, Sniegoski LT, White VE. Development of a confirmatory chemical test for exposure to 3-quinuclidinyl benzilate (BZ). Chem Abstr. 1987;110:70602Byrd GD, Sniegoski LT, White VE. Development of a confirmatory chemical test for exposure to 3-quinuclidinyl benzilate (BZ). Chem Abstr. 1987;110:70602Byrd GD, Sniegoski LT, White VE. Determination of 3-quinuclidinyl benzilate in urine. J Res Natl Bur Stand. 1988;93:293–95. https://doi.org/10.6028/jres.093.050Byrd GD, Sniegoski LT, White VE. Determination of 3-quinuclidinyl benzilate in urine. J Res Natl Bur Stand. 1988;93:293–95. https://doi.org/10.6028/jres.093.050Byrd GD, Paule RC, Sander LC, Sniegoski LT, White E, Bausum HT. Determination of 3-quinuclidinyl Benzilate (QNB) and Its Major Metabolites in Urine by Isotope-Dilution Gas-Chromatography Mass-Spectrometry. J Anal Toxicol. 1992;16:182-7. https://doi.org/10.1093/jat/16.3.182Byrd GD, Paule RC, Sander LC, Sniegoski LT, White E, Bausum HT. Determination of 3-quinuclidinyl Benzilate (QNB) and Its Major Metabolites in Urine by Isotope-Dilution Gas-Chromatography Mass-Spectrometry. J Anal Toxicol. 1992;16:182-7. https://doi.org/10.1093/jat/16.3.182Uher M, Mžik M, Karasová JŽ, Herman D, Čechová L, Dlabková A, Hroch M. In vitro and in vivo metabolism of 3-quinuclidinyl benzilate by high-resolution mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2020;120:113519 https://doi.org/10.1016/j.jpba.2020.113519Uher M, Mžik M, Karasová JŽ, Herman D, Čechová L, Dlabková A, Hroch M. In vitro and in vivo metabolism of 3-quinuclidinyl benzilate by high-resolution mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2020;120:113519 https://doi.org/10.1016/j.jpba.2020.113519Herman D, Dlabkova A, Cechova L, Vanova N, Misik J, Jun D, Zdarova Karasova J. Simple validated method of LC-MS/MS determination of BZ agent in rat plasma samples. Drug Test Anal. 2020;12(4):431-38. https://doi.org/10.1002/dta.2742Herman D, Dlabkova A, Cechova L, Vanova N, Misik J, Jun D, Zdarova Karasova J. Simple validated method of LC-MS/MS determination of BZ agent in rat plasma samples. Drug Test Anal. 2020;12(4):431-38. https://doi.org/10.1002/dta.2742Dlabkova A, Herman D, Cechova L, Hroch M, Vanova N, Zdarova Karasova J. 3-Quinuclidinyl benzilate (agent BZ) toxicokinetics in rats. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2021;129(3):246-55. https://doi.org/10.1111/bcpt.1362Dlabkova A, Herman D, Cechova L, Hroch M, Vanova N, Zdarova Karasova J. 3-Quinuclidinyl benzilate (agent BZ) toxicokinetics in rats. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2021;129(3):246-55. https://doi.org/10.1111/bcpt.1362Бонитенко ЕЮ, Бонитенко ЮЮ, Бушуев ЕС, Головко АИ, Горбачева ТВ, КуценкоСА и др. Острые отравления лекарственными средствами и наркотическими веществами. СПб.: ЭЛБИ-СПб; 2010. 440 с.Bonitenko EYu, Bonitenko YuYu, Bushuev ES, Golovko AI, Gorbacheva TV, Kucenko SA, et al. Acute poisoning by drugs and narcotic substances. SPb.: ELBY-SPb; 2010. 440 p.(in Russian).Веселовская НВ, Коваленко АЕ. Наркотики. М.: Триада-Х; 2000. 206 с.Veselovskaya NV, Kovalenko AE. Narkotics. M.: Triada-X; 2000. 206 p.(in Russian).

The authors declare that there are no conflicts of interest present.