nbsprotВестник войск РХБ защитыJournal of NBC Protection Corps2587-57283034-279127 Научный центр10.35825/2587-5728-2019-3-1-5-22cjragnnbsprot-226Research ArticleПРОБЛЕМЫ СОБЛЮДЕНИЯ КОНВЕНЦИЙ ПО ЗАПРЕЩЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО И БИОЛОГИЧЕСКОГО ОРУЖИЯISSUES OF COMPLIANCE WITH CHEMICAL AND BIOLOGICAL WEAPONS CONVENTIONSПолучение рекомбинантного белка сибиреязвенного бактериолизина PlyPH и исследование in vitro его литических свойств в отношении микробных клеток Bacillus anthracisThe Production of the Recombinant Protein of Anthrax Bacteriolysine PlyPH and In Vitro Study of the Lytic Properties of the Protein Coded for them Against Bacillus anhracis Microbial CellsОнучинаН. В.OnuchinaN. V.

Онучина Наталья Викторовна. Младший научный сотрудник научно-исследовательского отдела, канд. биол. наук 

610000, г. Киров, Октябрьский проспект, д. 119

Natalia Victorovna Onuchina. Junior Researcher of Scientific and Research Department. Candidate of Biological Sciences

Oktyabrsky Avenue 119, Kirov 610000

23527@mil.ruКузнецовскийА. В.KuznetsovskiyA. V.

Кузнецовский Андрей Владимирович. Начальник отдела планирования научно-исследовательских работ – заместитель начальника научно-исследовательского центра по научно-исследовательской работе, канд. биол. наук

610000, г. Киров, Октябрьский проспект, д. 119

Andrey Vladimirovich Kuznetsovskiy. Chief of the Department of Planning Research Projects –Deputy Chief of the Scientific and Research Center for Scientific Research. Candidate of Biological Sciences

Oktyabrsky Avenue 119, Kirov 610000

СойбановВ. Д.SoybanovV. D.

Сойбанов Владимир Дмитриевич. Младший научный сотрудник научно-исследовательского отдела

610000, г. Киров, Октябрьский проспект, д. 119

Vladimir Dmitrievich Soybanov. Junior Researcher of Scientific and Research Department 

Oktyabrsky Avenue 119, Kirov 610000

Филиал федерального государственного бюджетного учреждения «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской ФедерацииРоссияBranch Office of the Federal State Budgetary Establishment «48 Central Scientific Research Institute» of the Ministry of Defense of the Russian FederationRussian Federation201910072023311522Copyright © Онучина Н.В., Кузнецовский А.В., Сойбанов В.Д., 20232023Онучина Н.В., Кузнецовский А.В., Сойбанов В.Д.Onuchina N.V., Kuznetsovskiy A.V., Soybanov V.D.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.nbsprot.ru/jour/article/view/226

Возбудитель сибирской язвы – Bacillus anthracis, вследствие распространенности его природных очагов на территории России, высокой вирулентности для человека и большинства млекопитающих, уникальной устойчивости споровых форм к воздействию факторов окружающей среды и неоднократного применения в террористических актах, представляет собой крайне опасный биологический агент. Поэтому необходим поиск новых эффективных препаратов для диагностики и лечения сибирской язвы, в том числе и заболеваний, вызванных антибиотико-устойчивыми штаммами B. anthracis. Новым направлением в диагностике, профилактике и лечении инфекционных заболеваний является использование литических ферментов видоспецифических бактериофагов. Цель работы – клонирование гена сибиреязвенного бактериолизина PlyPH в составе вектора pTrcHis2C в Escherichia coli и исследование in vitro литических свойств кодируемого им белка в отношении микробных клеток B. anthracis. По данным полного секвенирования геномов B. anthracis штаммов Ames, Stern 34F2 и JB17 был выявлен в составе их хромосомной ДНК профаг, утративший часть структурных генов, необходимых для его репликации, но сохранивший ген, имеющий высокую степенью гомологии с геном бактериолизина γ фага. Для амплификации и последующего клонирования гена PlyPH нами были разработаны праймеры, содержащие сайты узнавания рестриктаз EcoRI и BamHI. Амплификацию гена PlyPH в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с разработанной парой праймеров проводили, используя в качестве матрицы ДНК штамма Stern 34F2 сибиреязвенного микроба. На основе полученных продуктов амплификации и вектора pTrcHis2C нами сконструирована рекомбинантная плазмида, содержащая ген PlyPH синтеза бактериолизина и стабильно функционирующая в клетках рекомбинантного штамма E. coli. В ходе исследований установлено, что микробные клетки рекомбинантного штамма TOP10 E. coli обеспечивают продукцию бактериолизина сибиреязвенного профага − PlyPH, обладающего способностью in vitro лизировать вегетативные клетки вакцинного штамма B. anthracis СТИ-1.

The causative agent of anthrax - Bacillus anthracis, due to the prevalence of its natural foci in Russia, high virulence for humans and most mammals, the unique resistance of spore forms to environmental factors and repeated use in terrorist acts, is an extremely dangerous biological agent. Therefore, the search for new effective drugs for the diagnosis and treatment of anthrax, including diseases caused by antibiotic-resistant strains of B. anthracis is necessary. The use of lytic enzymes of species-specific bacteriophages is a new trend in the diagnosis, prevention and treatment of infectious diseases. The goal of this work is the cloning of the anthrax bacteriolysin PlyPH gene as part of the pTrcHis2C vector in Escherichia coli and the in vitro study of the lytic properties of the protein encoded by it against B. anthracis microbial cells. According to the complete sequencing of the B. anthracis genomes of the Ames, Stern 34F2 and JB17 strains, a prophage was found in their chromosomal DNA, which lost part of the structural genes necessary for its replication, but retained a gene with a high degree of homology with the bacteriolysin γ phage gene. For amplification and subsequent cloning of the PlyPH gene, we developed primers containing EcoRI and BamHI restriction enzyme recognition sites. Amplification of the PlyPH gene in a polymerase chain reaction (PCR) with a developed pair of primers was performed using the Stern 34F2 strain of the anthrax microbe as a template. Based on the obtained amplification products and the pTrcHis2C vector, we constructed a recombinant plasmid containing the bacteriolysin synthesis PlyPH gene and stably functioning in the cells of the recombinant E. coli strain. In the course of research, it has been established that microbial cells of the E. coli recombinant TOP10 strain provide for the production of the bacteriolysin of the anthrax prophage, PlyPH, which has the ability to in vitro lyse the vegetative cells of the STI-1 vaccine strain of B. anthracis.

Bacillus anthracisвектор pTrcHis2Cклонированиесибиреязвенный бактериолизин PlyPHсибиреязвенный профагсибирская язваBacillus anthracisvector pTrcHis2Ccloninganthrax bacteriolysin PlyPHanthrax prophageanthraxReferencesБургасов П.Н., Черкасский Б.Л., Марчук Л.М. и др. Сибирская язва. М.: Медицина, 1970.Burgasov P.N., Cherkasskii B.L., Marchuk L.M. et al. Sibirskaia iazva [Anthrax]. Moscow: Medicine Publ., 1970 (in Russian).Онищенко Г.Г., Васильев Н.Т., Литусов Н.В. и др. Сибирская язва: актуальные аспекты микробиологии, эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики. М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999.Onishchenko G.G., Vasil'ev N.T., Litusov N.V. et al. Sibirskaia iazva: aktual'nye aspekty mikrobiologii, epidemiologii, kliniki, diagnostiki, lecheniia i profilaktiki [Anthrax: Actual Aspects of Microbiology, Epidemiology, Clinic, Diagnosis, Treatment and Prevention]. Moscow: VUNMTs MZ RF Publ., 1999 (in Russian).Онищенко Г.Г. Инфекционные болезни – важнейший фактор биоопасности // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2003. № 3. С. 4–16.Onishchenko G.G. Infectious diseases - the most important factor of biohazard. Epidemologiia i infektsionnye bolezni [Epid. Infect. Diseases], 2003. no. 3. P. 4–16 (in Russian).Онищенко Г.Г., Федоров Ю.М., Тихонов Н.Г. и др. Противодействие биотерроризму как новая проблема эпидемиологии // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2003. № 2. С. 4–6.Onishchenko G.G., Fedorov Iu.M., Tikhonov N.G. et al. Counteracting bioterrorism as a new problem in epidemiology. Epidemiologiia i infektsionnye bolezni [Epid. Infect. Diseases], 2003, no. 2, P. 4–6 (in Russian).Inglesby T.V., Henderson D., Bartlett J.G. et al. Anthrax as a biological weapon. Updated recommendations for management // JAMA. 2002. V. 287. P. 2236–2252.Inglesby T.V., Henderson D., Bartlett J.G. et al. Anthrax as a biological weapon. Updated recommendations for management // JAMA. 2002. V. 287. P. 2236–2252.Pile J.C., Malone J.D., Eitzen E.M. et al. Anthrax as a potential biological warfare agent // Arch. Int. Med. 1998. V. 158. P. 429–434.Pile J.C., Malone J.D., Eitzen E.M. et al. Anthrax as a potential biological warfare agent // Arch. int. Med. 1998. V. 158. P.429–434.Young R. Bacteriophage lysis: mechanism and regulation // Microbiol. Rev. 1992. V. 56, № 3. P. 430–481.Young R. Bacteriophage lysis: mechanism and regulation // Microbiol. Rev. 1992. V. 56, No. 3. P. 430–481.Cheng Q., Nelson D., ZhuS. et al. Removal of group B streptococci colonizing the vagina and oropharynx of mice with a bacteriophage lytic enzyme // Antimicrobial Agents Chemotherapy. 2005. V. 49, № 1. P. 111–117.Cheng Q., Nelson D., Zhu S. et al. Removal of group B streptococci colonizing the vagina and oropharynx of mice with a bacteriophage lytic enzyme // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2005. V. 49, No. 1. P. 111–117.Jado I., Lopez R., Garcia E. et al. Phage lytic enzymes as therapy for antibiotic-resistant Streptococcus pneumoniae infection in a murine sepsis model // Antimicrobial Agents Chemotherapy. 2003. V. 52, № 6. P. 967–973.Jado I., Lopez R., Garcia E. et al. Phage lytic enzymes as therapy for antibiotic-resistant Streptococcus pneumoniae infection in a murine sepsis model // Antimicrobial Agents Chemotherapy. 2003. V. 52, No. 6. P. 967–973.Schuch R., Nelson D., Fischetti V.A. A bacteriolytic agent that detects and kills Bacillus anthracis // Nature. 2002. V. 418, № 22. P. 884–888.Schuch R., Nelson D., Fischetti V.A. A bacteriolytic agent that detects and kills Bacillus anthracis // Nature. 2002. V. 418, No. 22. P. 884–888.Yoong P., Schuch R., Nelson D. et al. PlyPH, a bacteriolytic enzyme with a broad pH range of activity and lytic action against Bacillus anthracis // J. Bacteriol. 2006. V. 188, № 7. P. 2711–2714.Yoong P., SchuchR., Nelson D., et al. PlyPH, a Bacteriolytic enzyme with a broad pH range of activity and lytic action against Bacillus anthracis // J. Bacteriol. 2006. V. 188, No. 7. P. 2711–2714.Маниатис Т., Фрич Э., Самбрук Дж. Молекулярное клонирование: пер. с англ. М.: Мир, 1984.Maniatis T., Frich E., Sambruk Dzh. Molecular Cloning. Transl. from Eng. Moscow: Mir Publ., 1984 (in Russian).

The authors declare that there are no conflicts of interest present.