nbsprotВестник войск РХБ защитыJournal of NBC Protection Corps2587-57283034-279127 Научный центр10.35825/2587-5728-2018-2-4-36-43yoqcstnbsprot-217Research ArticleБиологическая безопасность и защита от биологических угрозBiological Security and Protection against Biological ThreatsРазработка способа обнаружения и идентификации ДНК токсигенных штаммов Clostridium botulinum типов А, В, Е методом ПЦР в реальном времениDevelopment of a technique for DNA detection and identification of toxigenic strains of Clostridium botulinum types A, B, E by the Real-Time PCR methodЯновД. С.YanovD. S.

Янов Дмитрий Сергеевич. Младший научный сотрудник, канд. биол. наук

610000, г. Киров, Октябрьский проспект, д. 119

Yanov Dmitry Sergeevich. Junior Researcher. Candidate of Biological Sciences

Oktyabrsky Avenue 119, Kirov 610000

23527@mil.ruКузнецовскийА. В.KuznetsovskiyA. V.

Кузнецовский Андрей Владимирович. Заместитель начальника центра, канд. биол. наук

610000, г. Киров, Октябрьский проспект, д. 119

Kuznetsovskiy Andrey Vladimirovich. Deputy Head of the Centre. Candidate of Biological Sciences

Oktyabrsky Avenue 119, Kirov 610000

ДубровинМ. Ю.DubrovinM. I.

Дубровин Михаил Юрьевич. Старший научный сотрудник, канд. мед. наук

610000, г. Киров, Октябрьский проспект, д. 119

Dubrovin Mikhail Yuryevich. Senior Researcher. Candidate of Medical Sciences

Oktyabrsky Avenue 119, Kirov 610000

МиронинА. В.MironinA. V.

Миронин Александр Викторович. Ведущий научный сотрудник, д-р мед. наук., проф.

610000, г. Киров, Октябрьский проспект, д. 119

Mironin Aleksandr Viktorovich. Leading Researcher. Doctor of Medical Sciences, Professor

Oktyabrsky Avenue 119, Kirov 610000

ОнучинаН. В.OnuchinaN. V.

Онучина Наталья Викторовна. Младший научный сотрудник, канд. биол. наук

610000, г. Киров, Октябрьский проспект, д. 119

Onuchina Natalya Viktorovna. Junior Researcher. Candidate of Biological Sciences

Oktyabrsky Avenue 119, Kirov 610000

ФилипповА. В.FilippovA. V.

Филиппов Алексей Владимирович. Заместитель начальника научно-исследовательского отдела – начальник группы, канд. мед. наук 

610000, г. Киров, Октябрьский проспект, д. 119

Filippov Aleksey Vladimirovich. Deputy Head of the Scientific Research Department – Head of the Group of the Scientific Research Department. Candidate of Medical Sciences 

Oktyabrsky Avenue 119, Kirov 610000

Филиал федерального государственного бюджетного учреждения «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации (г. Киров)РоссияBranch Office of the Federal State Budgetary Establishment «48 Central Scientific Research Institute» of the Ministry of Defence of the Russian Federation (Kirov)Russian Federation201804072023243643Copyright © Янов Д.С., Кузнецовский А.В., Дубровин М.Ю., Миронин А.В., Онучина Н.В., Филиппов А.В., 20232023Янов Д.С., Кузнецовский А.В., Дубровин М.Ю., Миронин А.В., Онучина Н.В., Филиппов А.В.Yanov D.S., Kuznetsovskiy A.V., Dubrovin M.I., Mironin A.V., Onuchina N.V., Filippov A.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.nbsprot.ru/jour/article/view/217

Бактерия Clostridium botulinum вызывает у человека опасную токсикоинфекцию – ботулизм. Летальность при ботулизме в случаях несвоевременного обращения за медицинской помощью достигает 70% от количества заболевших. В основе патогенеза ботулизма лежит поражение центральной нервной системы токсином, продуцируемым C. botulinum. В настоящее время известно 7 антигенных типов такого токсина. Ботулотоксин входит в группу биологических агентов, наиболее вероятных в качестве средств биотерроризма. Так как ботулинический нейротоксин представляет собой сложный нуклеопротеиновый комплекс и следы ДНК могут быть обнаружены даже в очищенных препаратах токсина, мы разработали способ обнаружения и идентификации токсигенных штаммов Clostridium botulinum типов А, В, Е, наиболее часто вызывающих ботулизм у человека, основанный на выявлении остаточных количеств этой ДНК в ботулиническом токсине с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени. Основным препятствием для разработки способа обнаружения и идентификации ДНК токсигенных штаммов стала высокая вариабельность генов, ответственных за синтез ботулотоксина. Нами установлен участок гена, обладающий наименьшей гомологией у всех штаммов. Этому требованию отвечал фрагмент гена bont, кодирующий легкую цепь нейротоксина и обладающий высокой консервативностью в пределах штаммов C. botulinum, продуцирующих один тип токсина. Представлены результаты по определению аналитической чувствительности и специфической активности разработанного способа. Специфичность определения составила 100%, аналитическая чувствительность метода – 1×102 м.к./мл. Способ может быть использован для анализа продуктов питания, образцов клинических материалов и проб из окружающей среды, подозрительных на контаминацию токсигенными штаммами C. botulinum.

Botulism is dangerous toxic infection caused by a toxin produced by the bacterium Clostridium botulinum. The mortality rate from botulism can reach 70% of all cases of illness in case of untimely initiation of treatment. The pathogenesis of botulism involves the damage to the central nervous system by a toxin produced by C. botulinum. Currently there are seven recognized antigenic types of this toxin. Botulinum toxin is included into the group of biological agents and it is one of the most likely agents to be used in a biological attack. Since botulinum neurotoxin is a complex nucleoprotein complex and the traces of DNA can be detected even in purified toxin preparations, we have elaborated a technique for detecting and identifying DNA of toxigenic strains of Clostridium botulinum types A, B, E, that cause human botulism in most cases. This technique is based on the the detection of residual amounts of this DNA in botulinum toxin using multiplex real-time polymerase chain reaction (PCR) assay with fluorescent hybridization detection. The main obstacle to development of a technique for the detection and identification of DNA of toxigenic strains is the high variability of the genes responsible for the synthesis of botulinum toxin. We have established a region of the gene with the lowest homology in all strains. This requirement is met by a fragment of the bont gene that encodes a light chain of a neurotoxin and is highly conserved in the strains of C. botulinum producing one type of toxin. The paper represents the results of the definition of analytical sensitivity and specific activity of the developed method. The specificity of the determination is 100%, the analytical sensitivity – 1×102 mc./ml. The method can be used to analyze food, samples of clinical materials and environmental samples suspected of being contaminated with toxigenic strains of C. botulinum.

Clostridium botulinumбиотерроризмботулизмботулинический токсинген bontгибридизационно-флуоресцентная детекциянуклеопротеиновый комплекспороговый циклПЦР в реальном времениClostridium botulinumbioterrorismbotulismbotulinum toxinbont genefluorescent hybridization detectionnucleoprotein complexthreshold cycleReal Time PCRReferencesИнфекционные болезни: национальное руководство / Под ред. Ющука Н.Д., Венгерова Ю.Я. М.: 2009.Infectious diseases: national leadership / Ed. Yuschuk N.D., Vengerov Yu.Ya. M.: GEOTAR-Media, 2009. 1056 с. (in Russian).Супотницкий М.В. Биологическая война. Введение в эпидемиологию искусственных эпидемических процессов и биологических поражений: монография. М.: 2013.Supotnitsky M.V. Biological warfare. Introduction to the epidemiology of artificial epidemic processes and biological lesions: monograph. M.: 2013. (in Russian).Взаимодействие органов управления, учреждений и специализированных формирований при ликвидации последствий террористических актов с применением патогенных биологических агентов и опасных химических веществ МР 0100/3556-04-34 М., 2004. 42 с.Interaction of management bodies, institutions and specialized formations in the elimination of consequences of terrorist acts with the use of pathogenic biological agents and hazardous chemical substances МР 0100/3556-04-34 М., 2004. 42 с. (in Russian).Campbell K.D., Collins M.D., East A.K. Gene probes for identification of the botulinum neurotoxin gene and specific identification of neurotoxin types B, E, and F // J. Clin. Microbiol. 1993. V. 31. № 9. Р. 2255–2262.Campbell K.D., Collins M.D., East A.K. Gene probes for identification of the botulinum neurotoxin gene and specific identification of neurotoxin types B, E, and F // J. Clin. Microbiol. 1993. V. 31. № 9. Р. 2255–2262.Dahlenborg M., Borch E., Radstrom P. Development of a combined selection and enrichment PCR procedure for Clostridium botulinum types B, E, and F and its use to determine prevalence in fecal samples from slaughtered pigs // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. № 10. Р. 4781–4788.Dahlenborg M., Borch E., Radstrom P. Development of a combined selection and enrichment PCR procedure for Clostridium botulinum types B, E, and F and its use to determine prevalence in fecal samples from slaughtered pigs // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. № 10. Р. 4781–4788.Fach P., Gibert M., Griffais R., Guillou J.P., Popoff M.R. PCR and gene probe identification of botulinum neurotoxin A-, B-, E-, F-, and G-producing Clostridium spp. and evaluation in food samples // Appl. Environ. Microbiol. 1995. V. 61. № 1. Р. 389–392.Fach P., Gibert M., Griffais R., Guillou J.P., Popoff M.R. PCR and gene probe identification of botulinum neurotoxin A-, B-, E-, F-, and G-producing Clostridium spp. and evaluation in food samples // Appl. Environ. Microbiol. 1995. V. 61. № 1. Р. 389–392.Akbulut D., Grant K.А., McLauchlin J. Development and application of Real-Time PCR assays to detect fragments of the Clostridium botulinum types A, B, and E neurotoxin genes for investigation of human foodborne and infant botulism // Foodborne Pathog Dis. 2004. V. 1. № 4. P. 247–257.Akbulut D., Grant K.А., McLauchlin J. Development and application of Real-Time PCR assays to detect fragments of the Clostridium botulinum types A, B, and E neurotoxin genes for investigation of human foodborne and infant botulism // Foodborne Pathog Dis. 2004. V. 1. № 4. P. 247–257.Hill B.J., Skerry J.C., Smith T.J., Arnon S.S., Douek D.C. Universal and specific quantitative detection of botulinum neurotoxin genes // BMC Microbiology. 2010. № 10. Р. 267-304. DOI:10.1186/1471-2180-10-267.Hill B.J., Skerry J.C., Smith T.J., Arnon S.S., Douek D.C. Universal and specific quantitative detection of botulinum neurotoxin genes // BMC Microbiology. 2010. № 10. Р. 267-304. DOI:10.1186/1471-2180-10-267.Kitamura M., Sakaguchi S., Sakaguchi G. Purification and some properties of Clostridium botulinum type-E toxin // Biochim. Biophys. Acta. 1968. V. 168. № 2. Р. 207–217.Kitamura M., Sakaguchi S., Sakaguchi G. Purification and some properties of Clostridium botulinum type-E toxin // Biochim. Biophys. Acta. 1968. V. 168. № 2 Р. 207–217.Kozaki S., Sakaguchi S., Sakaguchi G. Purification and some properties of progenitor toxins of Clostridium botulinum type B // Infect. Immun. 1974. V. 10. № 4. Р. 750–756.Kozaki S., Sakaguchi S., Sakaguchi G. Purification and some properties of progenitor toxins of Clostridium botulinum type B // Infect. Immun. 1974. V. 10. № 4. Р. 750–756.Hill K.K., Xie G., Foley B.T., Smith T.J. Genetic diversity within the botulinum neurotoxin-producing bacteria and their neurotoxins // Toxicon. 2015. V. 107. P. 2–8. DOI: 10.1016.Hill K.K., Xie G., Foley B.T., Smith T.J. Genetic diversity within the botulinum neurotoxin-producing bacteria and their neurotoxins // Toxicon. 2015.V. 107. P. 2–8. DOI: 10.1016.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.