nbsprotВестник войск РХБ защитыJournal of NBC Protection Corps2587-57283034-279127 Научный центр10.35825/2587-5728-2018-2-2-51-60yoqcktnbsprot-194Research ArticleБиологическая безопасность и защита от биологических угрозBiological Security and Protection against Biological ThreatsГенетическое конструирование рекомбинантого штамма Bacillus subtilis, продуцирующего протективный антиген сибиреязвенного микробаGenetic Construction of Bacillus subtilis Recombinant Strain, Producing Protective Antigen of Anthrax MicrobeОнучинаН. В.OnuchinaN. V.

Онучина Наталья Викторовна. Младший научный сотрудник научно-исследовательского отдела, канд. биол. наук 

610000, г.Киров, Октябрьский проспект, д. 119

Onuchina Natalia Victorovna. Junior Researcher of the Scientific and Research Department. Candidate of Biological Sciences 

Oktyabrsky Avenue 119, Kirov 610000

NIC48CNII@mil.ruКузнецовскийА. В.KuznetsovskyA. V.

Кузнецовский Андрей Владимирович. Начальник научно-исследовательского управления, канд. биол. наук 

610000, г.Киров, Октябрьский проспект, д. 119

Chief of the Scientific and Research Branch. Candidate of Biological Sciences 

Oktyabrsky Avenue 119, Kirov 610000

ВоробьевА. А.VorobyovA. A.

Воробьев Алексей Анатольевич. Ведущий научный сотрудник научно-исследовательского отдела, д-р биол. наук 

610000, г.Киров, Октябрьский проспект, д. 119

Leading Researcher of the Scientific and Research Department. Doctor of Biological Sciences 

Oktyabrsky Avenue 119, Kirov 610000

ФилипповА. В.FilippovA. V.

Филиппов Алексей Владимирович. Заместитель начальника научно-исследовательского отдела – начальник группы научно-исследовательского отдела, канд. мед. наук 

610000, г.Киров, Октябрьский проспект, д. 119

Deputy Chief of the Scientific and Research Department – Head of the Group of the Scientific and Research Department. Candidate of Medical Sciences 

Oktyabrsky Avenue 119, Kirov 610000

Филиал федерального государственного бюджетного учреждения «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской ФедерацииРоссияBranch Office of the Federal State Budgetary Establishment «48 Central Scientific Research Institute» of the Ministry of Defence of the Russian FederationRussian Federation201802072023225160Copyright © Онучина Н.В., Кузнецовский А.В., Воробьев А.А., Филиппов А.В., 20232023Онучина Н.В., Кузнецовский А.В., Воробьев А.А., Филиппов А.В.Onuchina N.V., Kuznetsovsky A.V., Vorobyov A.A., Filippov A.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.nbsprot.ru/jour/article/view/194

Сибирская язва является особо опасным зооантропонозным заболеванием, которое характеризуется тяжестью течения и высокой летальностью. Споры Bacillus anthracis обладают способностью длительно сохраняться в окружающей среде. На эндемичной территории сибиреязвенная инфекция может стать причиной массового заболевания людей и сельскохозяйственных животных. Кроме того, существует угроза применения биологических средств на основе возбудителя сибирской язвы террористическими организациями. Эпидемиологическое благополучие по сибирской язве напрямую зависит от вакцинации восприимчивых животных и населения групп риска. Многие из существующих сибиреязвенных вакцинных штаммов характеризуются низким уровнем продукции протективного антигена и высокой реактогенностью. Перспективным направлением создания вакцинных препаратов нового поколения является клонирование отдельных детерминант иммуногенности сибиреязвенного микроба в гомо­ и гетерологичных живых системах с целью создания высокоэффективных продуцентов протективного антигена B. anthracis. Цель работы заключалась в проведении исследований по получению рекомбинантного штамма Bacillus subtilis, продуцирующего протективный антиген сибиреязвенного микроба, перспективный для использования в технологии химических сибиреязвенных вакцин. В статье представлены результаты исследований по получению рекомбинантного штамма B. subtilis. На основе челночного вектора рHТ43 сконструирована плазмида pНТ43PA, содержащая ген pag синтеза протективного антигена сибиреязвенного микроба и стабильно функционирующая в клетках рекомбинантного штамма Amy21(pHT43РА) B. subtilis. В ходе исследований установлено, что микробные клетки рекомбинантного штамма Amy21(pHT43РА) B. subtilis обеспечивают продукцию иммунологически активного протективного антигена в количестве, не уступающем сибиреязвенным вакцинным штаммам. Полученные в ходе работ данные, а также безопасность, неприхотливость, изученность В. subtilis позволяют предложить данный рекомбинантный штамм для дальнейшего исследования в качестве продуцента сибиреязвенного протективного антигена, перспективного для использования в качестве химической составляющей сибиреязвенных вакцин.

Anthrax is a serious infectious disease with high mortality. The epidemiological security depends on the vaccination of susceptible animals and population at risk. But many of the existing anthrax vaccine strains possess low levels of protective antigen production and high reactogenicity. One of the most promising trends in production of new generation of vaccines is the cloning of particular determinants of immunogenicity of anthrax microbe for the creation of highly effective producers of Bacillus anthracis protective antigen. The aim of the article is to present the results of the study on the construction of recombinant Bacillus subtilis strain, producing B.anthracis protective antigen, promising for use in chemical anthrax vaccines technology. The pHT43PA plasmid containing the gene pag, providing the synthesis of protective antigen of the anthrax microbe and functioning stably in the cells of the recombinant strain Amy21(pHT43РА) of B. subtilis, was constructed on the basis of the shuttle vector pHT43. It is found out during the research, that the microbial cells of the recombinant strain Amy21(pHT43РА) of B. subtilis provide the production of immunologically active protective antigen in quantities, not inferior than anthrax vaccine strains. These data, as well as safety and simplicity of В. subtilis make it possible to continue the research of this recombinant strain as a producer of anthrax protective antigen, promising for use in vaccines production.

Bacillus subtilisген pag Bacillus anthracisклонированиепротективный антиген сибиреязвенного микробачелночный (B. subtilis/E. coli) вектор pHT43Bacillus subtilisgene pag Bacillus anthraciscloningprotective antigen of the anthrax microbethe shuttle (B. subtilis / E. coli) vector pHT43ReferencesБургасов П.Н., Черкасский Б.Л., Марчук Л.М. и др. Сибирская язва. М.: Медицина, 1970.Burgasov P.N., Cherkasskii B.L., Marchuk L.M. et al. Anthrax. Moscow Medicine, 1970. (in Russian).Бондарев В.П., Филиппов А.В., Дармов И.В. и др. Разработка иммуноферментной моноклональной тест-системы для обнаружения протективного антигена Bacillus anthracis // Проблемы особо опасных инфекций. 2007. T. 93. С 66–69.Bondarev V.P., Filippov A.V., Darmov I.V. et al. Development of an immunoenzyme monoclonal test system for the detection of the protective antigen of Bacillus anthracis // Problems of Especially Dangerous Infections. 2007. T. 93. P. 66–69. (in Russian).Онищенко Г.Г., Васильев Н.Т., Литусов Н.В. и др. Сибирская язва: актуальные аспекты микробиологии, эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики. М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999.Onishchenko G.G., Vasil'ev N.T., Litusov N.V. et al. Anthrax: actual aspects of microbiology, epidemiology, clinic, diagnosis, treatment and prevention. Moscow, VUNMTs MZ RF, 1999. (in Russian).Онищенко Г.Г. Инфекционные болезни – важнейший фактор биоопасности // Эпидемология и инфекционные болезни. 2003. № 3. С. 4–16.Onishchenko G.G. Infectious diseases – the most important factor of biohazard // Epid. and Infect. Diseases. 2003. № 3. P. 4–16. (in Russian).Кутырев В.В., Смирнова Н.И. Генодиагностика и молекулярное типирование чумы, холеры и сибирской язвы // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2003. № 1. С. 6–14.Kutirev V.V., Smirnova N.I. Genetic diagnostics and molecular typing of plague, cholera and anthrax // Molecular Genetics, Microbiology and Virology. 2003. № 1. P. 6–14. (in Russian).Онищенко Г.Г., Федоров Ю.М., Тихонов Н.Г. и др. Противодействие биотерроризму как новая проблема эпидемиологии // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2003. № 2. С. 4–6.Onishchenko G.G., Fedorov Iu.M., Tikhonov N.G. et al. Counteracting bioterrorism as a new problem in epidemiology // Epid. and Infect. Diseases. 2003. № 2, P. 4–6. (in Russian).Inglesby T.V., Henderson D., Bartlett J.G. et al. Anthrax as a Biological Weapon. Updated recommendations for management // JAMA. 2002. V. 287. P. 2236–2252.Inglesby T.V., Henderson D., Bartlett J.G. et al. Anthrax as a biological weapon. Updated recommendations for management // JAMA. 2002. V. 287. P. 2236–2252.Pile J.C., Malone J.D., Eitzen E.M. et al. Anthrax as a Potential Biological Warfare Agent // Arch. int. Med. 1998. V. 158. P. 429–434.Pile J.C., Malone J.D., Eitzen E.M. et al. Anthrax as a potential biological warfare agent // Arch. int. Med. 1998. V. 158. P. 429–434.Васильев Н.Т., Пименов Е.В., Кожухов В.В. и др. Перспективы создания сибиреязвенных вакцин нового поколения // Иммунология. 1999. № 3. С. 5–8.Vasil'ev N.T., Pimenov E.V., Kozhukhov V.V. et al. Prospects for the creation of a new generation anthrax vaccine // Immunology. 1999. № 3. P. 5–8. (in Russian).Mikesell P., Ivins В., Ristroph J. Evidence for plasmid-mediated toxin production in Bacillus anthracis // Infect. Immun. 1983. V. 39. P. 371–376.Mikesell P., Ivins В., Ristroph J. Evidence for plasmid-mediated toxin production in Bacillus anthracis // Infect. Immun. 1983. V. 39. P. 371–376.Okinaka R., Cloud K., Hampton O. et al. Sequence and organization of pX01, the large Bacillus anthracis plasmid harboring the anthrax toxin genes // J. Bacteriol. 1999. V. 181. P. 6509–6515.Okinaka R., Cloud K., Hampton O. et al. Sequence and organization of pX01, the large Bacillus anthracis plasmid harboring the anthrax toxin genes // J. Bacteriol. 1999. V. 181. P. 6509–6515.Klimpel K.R., Molloy S.S., Thomas G., Leppla S.H. Anthrax toxin protective antigen is activated by a cell surface protease with the sequence specificity and catalytic properties of furin // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 10277–10281.Klimpel K.R., Molloy S.S., Thomas G., Leppla S.H. Anthrax toxin protective antigen is activated by a cell surface protease with the sequence specificity and catalytic properties of furin // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 10277–10281.Leppla S.H. The anthrax toxin complex // Sourcebook of Bacterial Protein Toxins / Ed. Alouf J.F., Freer J.H. London: Academic Press, 1991. P. 277–302.Leppla S.H. The anthrax toxin complex // Sourcebook of Bacterial Protein Toxins / editors J.E. Alouf, J.H. Freer. Academic Press London. 1991. P. 277–302.Vodkin M., Leppla S. Cloning of the protective antigen gene of Bacillus anthracis // Cell. 1983. V. 34. P. 693–697.Vodkin M., Leppla S. Cloning of the protective antigen gene of Bacillus anthracis // Cell. 1983. V. 34. P. 693–697.Алимов А.П., Павлов В.М. Патент РФ на изобретение № 2110575. Рекомбинантная плазмидная ДНК pro PF5, определяющая синтез капсульного антигена F1 возбудителя чумы и протективного антигена возбудителя сибирской язвы, и способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pro PF5 // Бюллетень № 13 от 10.05.1998.Alimov A.P., Pavlov V.M. The patent of the Russian Federation for invention No. 2110575. Recombinant plasmid DNA pro PF5, which determines the synthesis of the capsule antigen F1 of the plague and the protective antigen of the anthrax pathogen, and the method for constructing the recombinant plasmid DNA pro PF5. Bulletin No. 13 dated 10.05.1998. (in Russian).Тедиков В.М., Добрица А.П. Клонирование и экспрессия детерминанты протективного антигена Bacillus anthracis в клетках Escherichia coli, Ваcillus subtilis и Bacillus anthracis // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1993. № 2. С. 13–16.Tedikov V.M., Dobritsa A.P. Cloning and expression of the determinant of the Bacillus anthracis protective antigen in cells of Escherichia coli, Bacillus subtilis and Bacillus anthracis // Molecular genetics, microbiology and virology. 1993. № 2. P. 13–16. (in Russian).Chauhan V., Singh A., Waheed S. et al. Constitutive expression of protective antigen gene of Bacillus anthracis in Escherichia coli // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. V. 283. P. 308–315.Chauhan V., Singh A., Waheed S. et al. Constitutive expression of protective antigen gene of Bacillus anthracis in Escherichia coli // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. V. 283. P.308–315.Coulson N.M., Fulop M., Titball R.W. Bacillus anthracis protective antigen, expressed in Salmonella typhimurium SL3261, affords protection against anthrax spore challenge // Vaccine. 1994. V. 12. P. 1395–1401.Coulson N.M., Fulop M., Titball R.W. Bacillus anthracis protective antigen, expressed in Salmonella typhimurium SL3261, affords protection against anthrax spore challenge // Vaccine. 1994. V. 12. P. 1395–1401.Zegers N, Kluter E., van Der Stap H. et al. Expression of the protective antigen of Bacillus anthracis by Lactobacillus casei: Towards the development of an oral vaccine against anthrax // J. Appl. Microbiol. 1999. V. 87. P. 309–314.Zegers N, Kluter E., van Der Stap H. et al. Expression of the protective antigen of Bacillus anthracis by Lactobacillus casei: Towards the development of an oral vaccine against anthrax // J. Appl. Microbiol. 1999. Vol. 87. P. 309–314.Pavlov V., Tedikov V., Mokrievich A. Cloning of pXOI and pag-gene of Bacillus anthracis in Francisella tularensis // International Workshop on Anthrax, 19-21 September 1995. Winchester, England. 1995. P. 108–109.Pavlov V., Tedikov V., Mokrievich A. Cloning of pXOI and pag-gene of Bacillus anthracis in Francisella tularensis // International Workshop on Anthrax, 19-21 September 1995. Winchester, England. 1995. P. 108–109.Baillie L. W. J., Moir A., Manchee R. The expression of the protective antigen Bacillus anthracis in Bacillus subtilis // J. Appl. Microbiol. 1998. Vol. 84. P. 741– 746.Baillie L. W. J., Moir A., Manchee R. The expression of the protective antigen Bacillus anthracis in Bacillus subtilis // J. Appl. Microbiol. 1998. V. 84. P. 741–746.Cohen S., Mendelson L., Altboum Z. et al. Attenuated nontoxinogenic and nonencapsulated recombinant Bacillus anthracis spore vaccines protect against anthrax // Infect. Immun. 2000. V. 68. P. 4549–4558.Cohen S., Mendelson L., Altboum Z. et al. Attenuated nontoxinogenic and nonencapsulated recombinant Bacillus anthracis spore vaccines protect against anthrax // Infect. and Immun. 2000. V. 68. P. 4549– 4558.Ivins В.E., Welkos S.L. Cloning and expression of the B. anthracis protective antigen in B. subtilis // Infect. Immun. 1986. V. 54. P. 537–542.Ivins В.E., Welkos S.L. Cloning and expression of the B.anthracis protective antigen in B.subtilis // Infect. and Immun. 1986. V. 54. P. 537–542.Barnard J.P., Friedlander A.M. Vaccination against anthrax with attenuated recombinant strains of Bacillus anthracis that produce protective antigen // Infect. Immun. 1999. V. 67. P. 562–567.Barnard J.P., Friedlander A.M. Vaccination against anthrax with attenuated recombinant strains of Bacillus anthracis that produce protective antigen // Infect. and Immun. 1999. V. 67. P. 562–567.Клонирование ДНК. Методы / Под ред. Гловера Д. Пер. с англ. М.: Мир,1988.Cloning DNA. Methods / Ed. Glover D. Translation from English. Moscow: Mir, 1988. (in Russian).Экспериментально-производственный регламент № 862-99 производства вакцины сибиреязвенной комбинированной жидкой и сухой для подкожного применения. Киров, 1999.Experimental production schedule of production of anthrax vaccine combined liquid and dry for subcutaneous application № 862-99. Kirov, 1999. (in Russian).Bacillus subtilis Expression Vectors Product Information and Instructions, 2005.Bacillus subtilis expression vectors product information and instructions, 2005.Молекулярная клиническая диагностика. Методы / Под ред. Херрингтона С., Макги Дж. Пер. с англ. М.: Мир, 1999.Molecular clinical diagnosis. Methods/ Ed. Khyerrington S., Makgi J. Translation from English. Moscow: Mir, 1999. (in Russian).Маниатис Т., Фрич Э., Самбрук Дж. МолекуManiatis T., Frich E., Sambruk Dzh. Molecular cloning. Translation from English. Moscow: 1984. (in Russian).MUK 4.1/4.2.588–96. Methods for monitoring medical immunobiological drugs administered to people. Moscow, 1996. (in Russian).MUK 4.1/4.2.588–96. Methods for monitoring medical immunobiological drugs administered to people. Moscow, 1996. (in Russian).

The authors declare that there are no conflicts of interest present.